20xx-20xx年第二章基因工程习题答案

20xx-20xx年第二章基因工程习题答案内容摘要：

制、产物诱导表达、载体诱导复制及促进产物分泌等。 1什么是基因诊断。 基因诊断中常用的方法有哪些。 试简述其中一种方法的原理。 基因诊断是指用分子生物学的技术对引起疾病的原因 —— 遗传基因、致病微生物和寄生虫 ,以及某些恶性肿瘤在基因水平上进行病原学和细胞遗传基因的检测和分析。 基因诊断中常用的方法有核酸分子杂交、 PCR、 DNA芯片技术、限制酶酶谱分析和 DNA序列测定等。 核酸分子杂交是基因诊断的最基本的方法之一。 它的基本原理是：互补的核酸单链能够在一定条件下结合成 双链，即能够进行杂交。 它不仅能在 DNA和 DNA之间进行，也能在DNA和 RNA之间进行。 因此，当用一段已知基因的核酸序列作探针，与变性后的单链基因组 DNA接触时，如果两者的碱基完全配对，它们即互补地结合成双链，从而表明被测基因组 DNA中含有已知的基因序列。 1名词解释：基因探针 基因芯片 蛋白质工程 基因探针（ probe） ： 就是一段与目的基因 DNA 互补的带有能检测标记物的特异核苷酸序列，它可以包括整个基因，也可以仅仅是基因的一部分；可以是 DNA 本身，也可以是由之转录而来的 RNA。 基因芯片 (gene chip)： 又称 DNA 芯片，是指将许多特定的寡核苷酸片段或基因片段有规律地排列固定于支持物上，样品 DNA/ RNA 通过 PCR 扩增、体外转录等技术掺入荧光标记分子，然后按碱基配对原理进行杂交，再通过荧光检测系统等对芯片进行扫描，并配以计算机系统对每一探针上的荧光信号作出比较和检测，从而迅速得出所要的信息。 蛋白质工程： 是指在蛋白质空间结构和结构与功能研究的基础上 ,借助计算机等辅助设计来确定某一蛋白质分子的改造方案。 然后通过基因改造和基因工程技术获得新的蛋白质分子。 1简述包含体形成的原因和包含体 蛋白复性的主要步骤。 重组蛋白在细菌中表达时，尤其当表达目的蛋白量超过细菌体总蛋白量 10%时，会在细胞内与细菌杂蛋白、核酸等成分聚集成没有生物活性的直径 m 的固体颗粒，这种不溶性聚合体即包含体（ inclusion body）。 生成包含体的原因可能有是蛋白质合成速度太快，多肽链相互缠绕，影响了多肽链的正确折叠，导致疏水基团外露等。 （包含体的形成有利于防止蛋白酶对表达蛋白的降解，并且非常有利于分离表达产物。 但包含体形成后，表达蛋白不具有生物活性，因此必须溶解包含体并对表达蛋白进行复性。 ） 包含体复性即从伸展态－中间体－后期中间体－天然态的过程，操作步骤一般为用超声波、匀浆等使菌体破碎后，离心得到包含体－加入强蛋白质变性剂如 6 ～ 8mol／ L 盐酸胍或 9～ 10mol／ L 尿素溶解包含体－用透析、稀释和超滤复性法等等方法使之正确折叠。 1列表比较大肠杆菌、酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞表达系统的优缺点。 比较指标表 达 系 统大肠杆菌 酵 母 菌 哺乳动物细胞 昆虫细胞1 ．外源基因表达水平高 比较高 不高 不高 (家蚕除外 )2 ．培养条件 易 易 难 较难3 ．表达产物的形式多数不能分泌，胞内形成包含体多数能分泌，少数在胞内形成包含体，有时产物不均一一般都能分泌 一般都能分泌4 ．表达产物的糖基化不能糖基化 能糖基化，但糖基化程度与天然产物有差别糖基化好，近似天然产物能糖基化，但糖基化程度与天然产物有差别5 ．产物纯化工艺细胞破壁容易，多数产物需 “复性 ” ，工艺较复杂胞内表达破壁困难；分泌物纯化工艺简单纯化简单 纯化较简单 (家蚕除外 )6 ．生产成本 高，主要化费在纯化方面低 高，主要花费在培养条件方面高，主要花费在培养条件方面 (家蚕除外 )7 ．稳定性 差 较好 好 较好8 ．难点 复性 破壁 培养 培养 以下为某同学作业答案，供参考 表达系统 优点 缺点 大肠杆菌表达系统 （ 1）对大肠杆菌的背景知识，特别是基因表达调控的分子 机理有深刻了解； （ 2）是一种安全的基因工程实验体系，拥有各类适用的寄主菌株和不同类型的载体； （ 3）许多克隆的真核基因都可以在大肠杆菌细胞中实现有效、高水平的表达； （ 4）大肠杆菌培养方便、操作简单、成本低廉，易用于批量生产。 （ 1）缺乏转录后加工机制，只能表达克隆的 cDNA,不宜表达真核基因组 DNA； （ 2）缺乏翻译后加工机制，许多真核基因的蛋白质产物，都要经过转译后的加工修饰（正确折叠和组装），而大多数的这类修饰作用在细菌细胞中并不存在； （ 3）表达的蛋白质常形成不溶性包含体，需作复性处理； （ 4） 难于表达大量可溶性蛋白。 酵母表达系统 （ 1）基因背景了解清楚，上游操作简单，生长迅速，非常适于大规模发酵。 （ 2）具有一定的加工及修饰能力：如二硫键的正确形成，前体蛋白的水解加工。 表达产物与天然蛋白相同或类似。 （ 3）可将异源蛋白基因与 N末端前导肽等信号肽融合，指导新生肽的分泌，在分泌中可对表达的蛋白进行糖基化修饰，但其修饰糖链与高等真核细胞并不相同。 （ 4）可移去起始甲硫氨酸，避免了作为药物使用可能引起的免疫反应问题。 （ 1）产糖量过多因而损坏蛋白质的生物活性、安全性等； （ 2）糖基化修饰与高等 真核细胞并不相同。 昆虫细胞表达系统 （ 1）表达效率高。 重组蛋白的表达水平最高可达到细胞总蛋白的 50％。 （ 2）属于真核表达系统。 有糖基化作用、脂肪酸酰基化作用、氨基末端乙酰化作用以及磷酸化，有利于表达产物形成天然的高级结构，保持原有的生物活性与功能。 （ 3）杆状病毒能容纳较大的外源基因而不影响其本身的增殖。 （ 4）杆状病毒属于昆虫病毒。 具有高度特异的宿主范围，对脊椎动物和植物均无致病性。 病毒重组因失去多角体保护，在自然界的生存能力很弱，因此比较安全。 （ 5）应用晚期多角体蛋白基因启动子表达外源基因可 表达毒性蛋白。 （ 6）杆状病毒表达载体通用性广。 可表达来自病毒、细菌、真菌、植物和动（ 1）宿主细胞生长慢、 培养基昂贵、 含有免疫宿主蛋白、 杆状病毒感染会导致宿主死亡、因此每一轮蛋白合成均需重新感染。 （ 2）昆虫细胞内的糖基化方式与脊椎动物细胞内的糖基化方式有一定的差异，其糖蛋白的糖链结构多为简单的不分支结构。 物几乎所有的蛋白，并且能表达带有内含子的外源基因。 （ 7）重组杆状病毒除在体外昆虫培养细胞表达外源基因外，还能感染昆虫活体，在体内高效表达外源蛋白。 哺乳动物细胞表达系统 （ 1）产物的抗原 性、免疫原性和功能与天然蛋白质最接近，糖基化等后加工最精确。 （ 2）一般会产生正确加工的、有活性的蛋白。 该表达系统的表达水平较低、培养基昂贵、生长缓慢、含有过敏物质等缺点在实际应用过程中较难避免。 1利用基因工程菌生产有哪些特点。 有什么优势。 常用的宿主菌有哪些。 基因工程菌带有外源基因，这些基因可能不稳定。 丢失外源基因的菌往往比未丢失的菌生长快得多，这样就会大大降低产物的表达。 为了抑制基因丢失的菌的生长，一般在培养中加入选择压力，如抗生素。 基因工程菌的培养一般分两段。 前期是菌体生长，生长到某一 阶段，加入诱导因子，诱发产物表达。 利用基因工程菌生产的优势主要体现在目的产物产量高，表达调控性好，可根据目的产物特点构建各种表达系统，等等。 常用宿主 菌有 大肠杆菌 （如 BL21(DE3)plysS 菌株）、 酵母菌 （如 Pichia pastoris、Saccharomyces cerevisiae 等） 、 枯草芽孢杆菌 等。 在基因工程菌培养过程中为什么质粒会丢失。 （ 1） 分离的不稳定性：细胞分裂过程中，有一个子细胞没有获得质粒 DNA 拷贝，并最终增殖成为无质粒的优势群体。 即在细胞分裂过程中发生的质粒不平均的 分配，导致质粒丢失，亦叫做质粒分离的不稳定性。 （ 2） 培养体系中因为各种原因使选择压力消失，无质粒载体细胞速度快，而含有质粒载体的寄主细胞重了代谢的负荷，降低了生长的速度，最终体系中前者占多数。 （ 3） DNA 重组等其他原因。 2基因工程菌高表达的障碍是什么。 （ 1） 外源基因的不稳定，造成表达的下降。 如受体细胞中的限制修饰系统对外源重组 DNA 分子的降解等原因。 （ 2） 高生长速率与高表达之间的矛盾。 外源基因的高效表达严重干扰受体细胞正常的生长代谢。 （ 3） 乙酸的产生。 菌体生长所需能量大于菌体有氧代谢 所能提供的能量时，菌体往往会产生代谢副产物乙酸，严重影响产物表达。 （ 4） 蛋白的降解。 小分子蛋白在大肠杆菌中表达后不稳定，容易被细胞内蛋白酶降解失活 ，可采用 融合表达 方式加以解决。 2与大肠杆菌相比酵母作为宿主菌有什么优点。 酵母菌是 单细胞低等真核生物，易于培养、繁殖快、便于基因工程操作。 与大肠杆菌相比其优点为： （ 1） 具有真核生物的蛋白质翻译后加工的 基本 功能， 如二硫键的正确形成，前体蛋白的水解加工 、 糖链加工 ； 具有适合于真核生物基因产物正确折叠的细胞内环境和系统 ， 表达产物与天然蛋白相同或类似。 （ 2） 可 将异源蛋白基因与 N末端前导肽等信号肽融合，指导新生肽的分泌， 分泌外源蛋白质到培养液中，利于纯化。 （ 3） 可移去起始甲硫氨酸，避免了作为药物使用可能引起的免疫反应问题。 基因工程实验作业题 如果电泳结束后紫外灯下看不到条带，请分析可能的原因。 （ 1） DNA降解（避免核酸酶污染） （ 2）上样量不够 （ 3）光源不合适（ 254nm 透射） （ 4） SYBR GREEN I等染料量过少或漏加 （ 5）胶浓度不合适（根据目的条带长度来调整凝胶浓度，一般 ％左右。 ） （ 6）核酸提取、 PCR 反应失误 等等 上样缓 冲液的作用。 （ 1）螯合 Mg 2＋ ，防止电泳过程中 DNA被降解，一般上样缓冲液中含 10mmol/l 的 EDTA。 （ 2）增加样品密度以保证 DNA 沉入加样孔内，一般上样缓冲液中加入一定浓度的甘油或蔗糖，这样可以增加样品的比重。 （在大片段电泳中采用 Ficoll（聚蔗糖），可减少 DNA条带的弯曲和拖尾现象）。 （ 3）指示剂监测电泳的行进过程，一般加入泳动速率较快的溴酚蓝指示电泳的前沿，其率约与 300bp 的线状双链 DNA相同。 请分析 PCR 出现假阴性的可能原因。 PCR 反应的关键环节有①模板核酸的制备，② 引物的质量与特异性 ③酶的质量 ④ PCR循环条件。 寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。 （ 1） 模板原因：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有 Taq 酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。 ⑤模板核酸变性不彻底。 （ 2） 酶失活 （ 3） 引物：引物质量、两条引物的浓度是否对称，避免引物之间形成二聚体等。 （ 4） Mg2+浓度：过高可降低扩增特异性，浓度过低则影响 PCR 扩增产量甚至使扩增失败而不出扩增条带。 （ 5） 操作原因：反应体积的改变，未混匀。 （ 6） 物理原因：变性对 PCR 扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性 （ 7） 靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合。 范文最新推荐 21 工会党支部工作总结 [工会党支部工作总结 ] xxxx 年，我们工会党支部在师直党工委的正确领导下，认真学习贯彻 “ 三个代表 ” 重要思想，学习党的十六届四中全会精神，自觉用 “ 三个代表 ” 重要思想指导工作，进一步加强党支部的建设，在工作中较好的发挥了政治核心和战斗堡垒作用，工会党支部工作总结。 现将 xxxx 年的支部工作情况总结汇报如下。 一、努力加强党支部的思想建设、组织建设和作风建设 ：在工会全体党员中继续深入学习邓小平理论和 “ 三个代表 ” 的重要思想。 在党的十六大四中全会召开以后，认真学习大会的精神和文件，特别是对全会讨论通过的《关于加强中国共产党执政能力建设的决定》，不仅在支部成员内部认真学习贯彻，而且还在工会全体工作人员中传达贯彻学习。 坚持严肃认真地进行党员民主评议工作，切实解决党支部、党员中存在的问题和不足，努力提高全体党员的思想认识，为圆满完成全年的各项工作，提供思想保证。 同时开好领导班子民主生活会 ，认真征集职工意见，认真开展批评与自我批评，找差反思，并进行认真整改，进一步完善领导班子的工作。 全年共召开民主生活会 2 次，均取得了良好效果，大家普遍反映心更近了，关系更融洽了，工作氛围更加和谐了，团队的力量更加强大。