测序技术发展史

测序技术发展史内容摘要：

lexa 技术 Illumina 公司的 Genome Analyzer 于 2020 年问世，它是一种基于 Solexa 技术的测序系统。 该技术利用边合成边测序的方法（ sequencing by synthesis， SBS）， 它的原理是： ① 待测 DNA 文库的构建 把待测序列打断成 200500bp 的小片段，并在小片段两端加上不同的接头，连接载体，构建 ssDNA 文库。 ② DNA 与 流动槽（ flow cell） 的附着 将 DNA 片段变成单链后通过 接头与芯片表面的引物碱基互补而使一端固定在芯片上，另外一端 随机 和附近的另外一个引物互补，也被固定住，形成桥状结构。 流动槽是一种含有8 个 chanel 的微纤维板 ，它的表面固定有很多接头，能支持 DNA 在其表面进行桥式扩增。 ③ Bridge PCR（桥式 PCR） 向反应体系中添加未标记的 核苷酸和酶，进行 bridge PCR 扩增。 Bridge PCR 以流动槽表面的固定接头为模板，将桥型 ssDNA 扩增为桥型 dsDNA。 将桥型 dsDNA 变性为 ssDNA，继续扩增。 经不断的扩增 变性循环，每一种 ssDNA 都在各自的位置集中 成束（ cluster），每一束含有单个模板分子的 5001000 个拷贝 ，从而达到能支持下一个测序反应所需信号强度的模板量。 随后将 DNA 簇线性化。 ④ 测序 测序采用 边合成边测序的方法（ SBS）。 向反应体系中同时添加 DNA 聚合酶、接头引物和带有 碱基特异荧光标记的 4 种 dNTP（ 可逆终止子 ）。 由于这些 dNTP 的 3’羟基被化学方法保护，因而每轮合成反应只能添加一个 dNTP，在 dNTP 被添加到合成链上之后， 所有未使用的游离 dNTP 和 DNA 聚合酶会被洗脱。 加入激发荧光所需的缓冲液，用 激光激发荧光信号，用光学设备完成荧光 信号的记录，再通过计算机分析转化为测序结果。 当荧光 信号的记录完成后，加入化学试剂淬灭荧光信号并去除 dNTP 的 3’羟基保护基团， 以便进行下一轮测序反应。 Solexa 测序技术流程 2020 年， Solexa 推出 对读测序方法（ pairedend）方法 （或末端配对法） ，即在构建待测DNA 文库时在两端的接头上都加上测序引物结合位点，在第一轮测序完成后 ，去除第一轮测序的模板链，用对读测序模块（ PairedEnd Module） 引导 互补链在原位置再生和扩增，以达到第二轮测序所用的模板量，进行第二轮互补链的测序。 优缺点。 使用对读测序方法， Solexa 读取长度可达 2*75bp，相比 454 后续序列拼接工作的计算量和难度大大 增加。 但由于 Solexa 技术在合成中每次只能添加一个 dNTP，因此很好地解决了同聚物长度的准确测量问题。 其主要错误来源为核苷酸的替换，而不是插入或缺失。 （ 3） ABI 的 SOLiD 技术 SOLiD 全称 Supported Oligo Ligation Detetion， ABI 的 SOLiD 测序系统 基于连接酶测序法，即利用 DNA 连接酶在连接过程中进行测序。 它的原理是： ① 待测 DNA 文库的构建 SOLiD 系统支 持两种测序模板：片段文库（ fragment library）或配对末端文库（ matepaired library）。 片段文库就是 把待测序列打断成很小的片段，并在小片段两端加上不同的接头，连接载体，构建 ssDNA 文库。 该文库适合转录组测序、 RNA 定量、 miRNA 研究、重测序、 3’,5’RACE、甲基化分析及 ChIP 测序等。 配对末端文库是将基因组 DNA 打断后，与中间接头连接，环化，然后用 EcoP15 酶切，使中间接头两端各有 27bp 的碱基，最后加上两端接头，形成文库。 该文库适用于全基因组测序、 SNP 分析、结构 重排及拷贝数分析等。 ② Emulsion PCR 与 454 技术的 Emulsion PCR 类似，将带接头的 ssDNA 固定在磁珠表面，进行 PCR 扩增，并对扩增产物进行 3’端修饰。 ③连接酶测序 将 3’端修饰的磁珠沉积于上样玻片（ Slide） ，进行连接酶测序。 在沉积过程中可对磁珠密度进行调整，以达到最大通量。 向 体系中加入 DNA 连接酶、通用测序引物 n 和具有3’XXnnnzzz5’结构的的八聚核苷酸。 在 这个八聚核苷酸中，第 1 和第 2 位（ XX）上的碱基是确定的，并根据种类的不同在第 68 位（ zzz）上加了不同的荧光标 记。 这种由两个碱基决定的测序方法被称为两碱基测序（ two base encoding）。 当八聚核苷酸因第 1 和第 2 位配对而被连接酶连接上时，会发出荧光。 在记录下荧光信息后，通过化学方法在第 5 和第 6 位之 SOLiD 测序技术流程 间进行切割，淬灭荧光信号，以进行下一个位置的测序。 通过这种方法，每次测序的位置都相差五位，即第一次测第 1 和第 2 位，第二次测第 6 和第 7 位„„在测到末尾后，将新和成的链变性、洗脱。 然后用通用引物 n1 进行第二轮测序。 接下来， 分别加入通用测序引物 nn n4 进行测序，这样可以完成全 部位置的测定，且每个位置均被测定了 2 次。 优缺点。 与 Solexa 类似，后续的序列拼接工作非常复杂。 但由于采用两碱基测序，准确率较高。 第三代测序技术 Helicos 公司的 Heliscope 单分子测序仪、 Pacific Biosciences 公司的 SMRT 技术和 Oxford Nanopore Technologies 公司研究的纳米孔单分子测序，被认为是第三代测序技术。 其最大的特点是单分子测序。 其中， Heliscope 技 术和 SMRT 技术利用荧光信号进行测序，而纳米孔单分子测序技术利用不同碱基产生的电信号进行测序。 Helicos 公司的 Heliscope 单分子测序仪基于边合成边测序的思想。 将待测序列打断成小片段并在 3’端加上 poly（ A），用末端转移酶在接头末端加上 Cy3 荧光标记。 用小片段与表面带有寡聚 Poly（ T）的平板杂交。 然后加入 DNA 聚合酶和 Cy5 荧光标记的 dNTP 进行 DNA合成反应，每一轮反应加入一种 dNTP。 将未参与合成的 dNTP 和 DNA 聚合酶洗脱，检测上一步记录的杂交位置是否有荧光信号，若有，则说明该位置结合了 所加入的这种 dNTP，用化学试剂去掉荧光标记，以便下一轮反应。 经过不断地重复合成、洗脱、成像、淬灭过程完成测序。 读取长度约为 3035bp，每循环数据产出量为 2128Gb。 类似 454，在面对同聚物时有一些困难，但并不十分严重。 同聚物合成导致荧光信号减弱，可据此推测同聚物长度；另外可通过二次测序来提高准确度。 对 Heliscope 来说，主要错误来源是缺失，由合成中可能掺有未标记的碱基所致。 斯坦福大学的科学家利用 heliscope 单分子测序仪，用了 48000 美元的试剂和 4 个星期的时间，对一名白人男子的基因组进 行了测序。 覆盖度达 28 倍，覆盖 90%人类参考基因组，读长 2470bp，平均读长 32bp，并鉴定出 280 万个 SNP 位点和 752 万个拷贝数变异。 Pacific Biosciences 的 SMRT 技术 基于边合成边测序的思想 ，以 SMRT 芯片为载体进行测序反应。 SMRT 芯片 是一种带有很多 ZMW（ zeromode waveguides）孔的厚度为 100nm的金属片。 将 DNA 聚合酶、待测序列和不同荧光标记的 dNTP 放入 ZMW 孔的底部 进行合成反应。 与其他技术不同的是，荧光标记的位置是磷酸基团而不是碱基。 当一个 dNTP 被 加入到合成链上的同时， 会进入 ZMW 孔的信号检测区并在激光束的激发下发出荧光，根据荧光种类可判断 dNTP 种类。 且由于其在检测区停留的时间 （ ms） 与进入、离开的时间 （μ s）相比很长，所以信号强度很大。 在下一个 dNTP 被添加之前，这个 dNTP 的磷酸集团会被氟聚合物（ fluoropolymer）切割并释放， 荧光分子离开荧光信号检测区。 SMRT 技术测序速度很快，可达每秒 10 个 dNTP。 SMRT 技术测序流程 Oxford Nanopore Technologies 公司正在研究的 纳米孔单分子技术是一种基于电信号测序 的技术。 他们 设计了一种 以α 溶血素为材料制作的纳米孔，在孔内共价结合有分子接头环糊精。 用核酸外切酶 切割 ssDNA 时， 被切下来的单个碱基会落入纳米孔，并和孔内的环糊精相互作用，短暂地影响流过纳米孔的电流强度，这种电流强度的变化幅度就成为每种碱基的特征 ， 碱基在纳米孔内的停留时间是毫秒级的，它的解离速率常数与电压有关， 180mV的电压就能够保证在电信号记录后将碱基从纳米孔中清除。 另一大特点 是 能够直接读取甲基化的胞嘧啶 ， 而不像传统方法那样必须要用重亚硫酸盐（ bisulfite）处理 ，这对于在基因组水平研究表观遗传相 关现象提供了巨大的帮助。 该方法准确率高，且发现错误易修正，因为4 种碱基中的 2 种与另外 2 种的电信号差异很明显。 另外，每次只测定一个核苷酸，很容易解决同聚物长度的测量问题。 目前面临的问题是寻找合适的外切酶载体以及承载纳米孔平台的材料。 目前，我国也启动了第三代测序技术的研究。 2020 年 12 月，中科院北京基因组研究所与浪潮成立“中科院北京基因组研究所 浪潮基因组科学联合实验室”，利用各自的优势联合研发国产第三代测序仪，第一台样机预计 2020 年问世，届时有望缓解测序仪核心技术受制于国外公司的现状。 测序技术的发展趋势 三代测序的比较见下页表。 测序成本 、 读取长度 和 测序通量 是评价测序技术先进与否的重要标准。 测序成本在一定。