生物技术毕业论文红掌组培快繁过程中污染原因的分析及对策探讨

生物技术毕业论文红掌组培快繁过程中污染原因的分析及对策探讨内容摘要：

入培养过程，引起的污染称为内生性污染或内源性污染。 主要有以下几类：黄单胞菌属、芽孢杆菌属、假单胞菌属、土壤杆菌属、棒状杆菌属、欧文氏菌属等。 真菌主要有霉菌。 在红掌初代培养中，表面细菌引起的污染通常在 2～ 3 天就能在外植体周围或培养基表面形成明显的如水污状、油污状、气泡或干缩的红、黄、乳白等颜色的菌落。 而在外植体培养后 3～ 5 天内并未发现细菌污染，以后则不 段 出现明显的或不明显的细菌菌落，就可能是由内 生细菌引起的污染[10]。 在红掌初代培养或前几代的继代培养中存在的污染，并不形成明显的菌落而只在培养基内部形成“丝状物”，“晕状物”，不易被肉眼发现的，对红掌中的内生细菌，由于它潜伏得较深，表面消毒方法无法将其消灭。 有时在外植体的初级培养中，包括前几代的继代培养，往往在培养基上不易被发现，随着继代培养次数的增加，菌量不断的积累，就会在培养基上表现出来。 对于这种情况，我们可以利用背光检查法去观察发现它 [11]。 污染原因判断及污染苗抢救 若污染菌类是零星分散在培养基中，则可确定是人为引起的污染，比 如培养基灭菌不彻底；超净工作台长时间不换滤网，致使净化能力降低；接种用具灭菌不彻底；操作不正确，动作生硬缓慢，开瓶时间太久，接种 9 台摆放物品杂乱，操作中心在人体范围之内；接种室长期不灭菌，菌类太多；若污染菌类是从材料周围长起，则可证明是植物材料带菌引起。 可能是接种用具灭菌不彻底，接种时材料被污染；或者是未及时发现污染苗，接种过程交叉感染；若是外植体，菌类从材料培养基以上部分长起，而不是从培养基先长起，且发生在 5 天以后，则说明是材料带的内生菌。 若从培养基以下开始长菌，发生时间较早，且有从里向外的趋势，则说明是切口引起的污染，原因有是灭完菌后，未剪去两个切口或虽剪但器具带菌 [12]。 真菌污染后，如果已形成孢子，则必须经高压灭菌后扔掉，即使仅形成菌丝，菌丝能够达到材料内部，因此，真菌污染是灭绝性的。 但若使细菌污染，由于细菌繁殖是靠芽孢，细菌不会弥散整个空间，因此只要及时发现，将材料上部未感菌的部分剪下转接，材料仍可以用。 用抗生素等杀菌药剂的处理，虽有不少报道，但至今还未发现那种抗生素能够对各种菌都有效，并且常常也会影响红掌材料的正常生长分化。 另一些药剂，虽有的杀菌效果好，但往往容易引起盐害，也无法利用 [13]。 预防方法和措施 基本方法 通风：经常开窗，保持室内空气流通．可以使室内真菌数量减少。 通风方法简便易行，应多使用。 去湿：保持室内空气干燥，如使用空调“除湿”功能，也可减少真菌生长繁殖。 光照：紫外线能杀灭或抑制真菌生长，有调查发现下午一时是大气细菌粒子沉降的一个低谷，说明太阳辐射对空气微生物有明显的杀灭作用。 因此，保持室内较好采光，在梅雨季节后将衣物等晾晒，对减少室内真菌污染大有好处 [14]。 防霉：污染物品和污染培养基不要在培养室近距离开瓶洗刷。 经常检查消毒锅的灭菌质量 消毒锅的压力表降到零后不能马上出锅。 因冷热空气作用的负压效应， 10 使外界环境的冷空气倒吸入已灭菌好的培养瓶内引起真菌污染，为避免该现象的发生，消毒后培养瓶应留在锅里，等冷却后才出锅。 如果出现培养基造成的污染，就要及时地检查灭菌锅的性能或其他的问题。 检查培养容器是否存在问题 培养容器封口多用塑料盖、胶塞、棉塞、薄膜等，塑料盖用久了易老化，密封性差，也会造成污染。 同时，培养瓶在使用之前要洗净（包括瓶内瓶外），灭好菌的培养瓶不要放在空气中太久，一般出锅后 1～ 2 天内接完种最好， 以减少培养瓶表面的微生物引起的污染。 继代培养中污染的控制 这类污染可以从以下 2 个方面进行防止。 (1)扩大繁殖时应有合理程序。 在获得的无菌培养物之后，应将其中一部分作为“原种”保存起来，分批繁殖和复检后再大规模生产。 （ 2）可通过在培养基中加入抗菌剂来防止。 多菌灵用于红掌组织培养的抑菌促生长，培养物不受微生物污染，灭菌率为 98%以上，无白化苗，生长健壮，不过这种方法不能广泛使用，因为有些植物在抑菌素会受到毒害，如叶片变小、变黄和不能分化等。 还有使用时要调到适合的浓度 [16]。 减少培养 基中的有机成分 培养基中有机成分的存在是污染产生的重要原因 ,去除有机物是减少污染的一条途径。 在红掌的组织培养中，除去培养基中的 VB VB烟酸等（保留肌醇）有机成分，经 2～ 3 代培养后，能抑制细菌生长，对丛生芽生长增殖没有影响。 原因是这些都是某些细菌生长的必须物质，去除这些有机成分后，细菌无法生长发育而慢慢死亡或减少。 由日本的古在丰树教授首创的无糖组织快繁技术则全部除去培养基中的有机成分，输入可控制量的 CO2 气体作为碳源，并通过控制环境因子，促进植株光合作用速率，使之由 异养型转变成自养型，因而植物长势良好，污染率明显降低 [17]。 11 结 论 污染 问题，是 红掌 组织培养过程 中 难以杜绝的现象。 污染 造成的后果是严重的，它会增加接种源及 污染 的几率，对 花卉 造成伤害，耗工耗时，提高生产成本。 对于如何控制 污染 ，以建立一个洁净、良好的工作与培养环境和无菌的植株系统为 组培 业所要努力的方向。 目前组培苗污染实验所遇到的问题为不易建立植株的干净度，因此无法确定真正的污染源来自何处，无法对症下药。 而且对于菌种的鉴定有很大的困难，因为一般有关植物或是植物病原菌，其背景资料较少，对于鉴定而言，便较 棘手。 在红掌组织培养中，一般的污染较容易控制，要达到接种的无菌环境条件，无菌操作要求和无菌操作水平。 而内源菌则较难控制，要求全部杀死植物表面和组织中的微生物，一般的消毒方法是不能完成的。 通过先对外植体植物进行预栽管理、外植体的预处理，并在这基础上，改进消毒方法，（如真空减压法、酸化培养基、灼烧法等），也可除去培养基中的有机成分，这些措施都能降低由内源菌引起的污染。 当然，在植物组织培养中，控制污染的方法是可灵活多变的，只要能减少污染，不会发生培养物的遗传变异，实现工厂化快繁，降低成本，能在市场竞争中占有一席之 地即可。 12 谢 辞 本课题在选题及研究过程中得到老师的悉心指导。 并为我指点迷津，帮助我开拓研究思路，精心点拨、热忱鼓励。 本文从材料的收集到撰都是在老师和同学们的关心和鼓舞下顺利进行的。 在这期间尽管老师很忙但它却仍然抽出时间为我修改论文，使我能够顺利的将本文完成。 同学们也不亦乐乎的为我提供帮助，他们积极的为我查资料并相互检查错误共同提高。 在我的写作过程中，老师多次指导我论文的写作方法和技巧，教我研究的思路和方向。 在我写作论文的期间，每当我遇到困难和疑惑时，老师总是一针见血的指出我的不足，帮助我 拨开迷雾、跨越困难的鸿沟。 老师始终为人师表，不厌其烦，令我感到无比钦佩。 本文是在 老师的精心指导下完成的， 在此我谨向赵老师致以崇高的敬意。 最后，不能忘记我的兄弟姐妹们 —— 我的同学和朋友们，在论文写作的过程中乃至三年的学习生活里，他们与我朝夕相处，互相讨论，共同进步。 在此我忠心的向所有帮助过我的老师和同学表示感谢。 13 参考文献 [1]李云 .林果花菜组织培养快速育苗技术，中国林业出版社， 2020， 1（ 2） :2325 [2]王青连 .植物组织培养 [M]，中国农业出版社， 2020： 2324. [3]周俊辉 .植物组织 快繁技术中存在的问题和对策《仲恺农业技术学院学报》， 1999， 12（ 4）： 6470 [4]朱广廉 .植物组织培养中的外植体灭菌《植物生理学通讯》 ,1996,32（ 6） :444446 [5]黄小荣 ,杨开太 .香水白掌的组织培养 ， 广西林业科学， 2020， 30（ 1）：3940 [6]韦三立 .花卉组织培养，中国林业出版社， 2020， 8（ 2） :4446 [7]柴向华 ,李军 ,张秀珊 .植物组织培养中污染的控制，《热带农业科学》 (6):4043 [8]熊丽，吴丽芳 .观赏花卉的组织培养与大规模生产 ， 化学工业出版社，2020， 8081 [9]李春燕，李颖 .组织培养中青霉素对细菌污染的抑制作用，东 北林业大学学报， 2020,28(5):9798 [10]李颖，李春燕 .多菌灵和青霉素在组培污染中的应用 ， 林业科技， 2020，27（ 1）： 68 [11]由翠荣 ,曲复宁 ,龚雪琴等 .迷你玫瑰组织培养中细菌污染的防止 [J]，植物生理学通讯 ,2020,40（ 1） :4647 [12]周俊辉，周厚高，刘花全 .植物组织培养中内生细菌污染问题《广西植物》 ， 2020， 23(1):4147 [13]biotec. 植物组织培 养苗之污染与检测 [EB/OL].2020， 15(1):1617 [14]林盛，马崇烈，胡东琼 . 组织培养中污染的控制 [J]， 广西农业科学，1994(2)： 8788. [15]于福科，张广军 .玫瑰组织培养污染控制技术措施 ， 陕西农业科学，2020(11):4748 14 [16]宋锋惠 ,李康 ,史彦江 .组织培养及快速繁殖技术研究 ， 新疆农业科学，2020， 39(6)： 343345 [17]肖玉兰 .植物无糖组培快繁工厂化生产技术 ， 云南科技出版社， 2020，3(2):14 15 附 录 灭菌方法 常用的灭 菌方法可分为物理的和化学的两类，即：物理方法如干热 (烘烧和灼烧 )、湿热 (常压或高压蒸煮 )、射线处理 (紫外线、超声波、微波 )、过滤、清洗和大量无菌水冲洗等措施；化学方法是使用升汞、甲醛、过氧化氢、高锰酸钾、来苏儿、漂白粉、次氯酸钠、抗菌素、酒精化学药品处理。 这些方法和药剂要根据工作中的不同材料不同目的适当选用湿热灭菌（培养基）培养基在制备后的 24h 内完成灭菌工序。 高压灭菌 方法是最常用的物理灭菌方法， 高压灭菌的原理是：在密闭的蒸锅内，其中的蒸气不能外溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅内温度也随之 增加。 在 的压力下，锅内温度达 121 ℃。 在此蒸气温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。 注意完全排除锅内空气，使锅内全部是水蒸气，灭菌才能彻底。 高压灭菌放气有几种不同的做法，但目的都是要排净空气，使锅内均匀升温，保证灭菌彻底。 常用方法是：关闭放气阀，通电后，待压力上升到 O． 05MPa 时，打开放气阀，放出空气，待压力表指针归零后，再关闭放气阀。 三次放气后，关阀再通电，压力表上升达 0． 1～ 0． 15Mpa 时，维持 15～ 20min。 对高压灭菌后不变质的物品，如无菌水、栽培介质、接种用具，可以延长 灭菌时间或提高压力。 而培养基要严格遵守保压时间，既要保压彻底，又要防止培养基中的成分变质或效力降低，不能随意延长时间。 对于一些布制品，如实验服、口罩等也可用高压灭菌。 洗净晾干后用耐高压塑料袋装好，高压灭菌 20～ 30min。 高压灭菌前后的培养基，其 pH 值下降 ～ 单位。 高压后培养基 pH 值的变化方向和幅度取决于多种因素。 在高压灭菌前用碱调高 pH 值至预定值的则相反。 培养基中成分单一时和培养基中含有高或较高浓度物质时，高压灭菌后的 pH 值变化幅度较大，甚至可大于 2 个 pH 值单位。 环境 pH 值的变化大于 单位就 有可能产生明显的生理影响。 高压灭菌通常会使培养基中的蔗糖水解为单糖 16 从而改变培养基的渗透压。 在 8%～ 20%蔗糖范围内，高压灭菌后的培养基约升高 倍。 培养基中的铁在高压灭菌时会催化蔗糖水解，可使15%～ 25%的蔗糖水解为葡萄糖和果糖。 培养基值小于 ，其水解量更多，培养基中添加 %活性炭时，高压下蔗糖水解大大增强，添加 1%活性炭，蔗糖水解率可达 5%。 灼烧灭菌（用于无菌操作的器械）在无菌操作时，把镊子、剪子、解剖刀等浸入 95%的酒精中，使用之前在酒精灯火焰 上 灼烧 灭 菌。 冷却后，立即使用。 操作中可 采用 250 或 500ml 的广口瓶，放入 95%的酒精，以便插入工具。 干热灭菌（玻璃器皿及耐热用具）干热灭菌是利用烘箱加热到 160～180。 C 的温度来杀死微生物。 由于在干热条件下，细菌的营养细胞的抗热性大为提高，接近芽 孢 的抗热水平，通常采用 170 ℃ 持续 90min 来灭菌。 干热灭菌的物品要预先洗净并干燥，工具等要妥为包扎，以免灭菌后取用时重新污染。 包扎可用耐高温的塑料。 灭菌时应渐进升温，达到顶定温度后记录时间。 烘箱内放置的物品的数量不宜过多，以免妨碍热对流和穿透，到指定时间断电后，待充分冷凉，才能打开烘箱，以 免因骤冷而使器皿破裂。 干热灭菌能源消耗太大，浪费时间。 过滤灭菌（不耐热的物质）一些生长调节剂，如赤霉素、玉米素、脱落酸和某些维生素是不耐热的，不能用高压灭菌处理，通常采用过滤灭菌方法。 可用无菌的孔径 ～ 的硝酸纤维素膜过滤菌类，当溶液通过滤膜后，细菌的细胞和真菌的孢子等因大于滤膜直径而被阻，在需要过滤灭菌的液体量大时，常使用抽滤装置；液量小时，可用注射器。 使用前对其高压灭菌，将滤膜装在注射器的靠针管处，将待过滤的液体装入注射器，推压注射器活塞杆，溶液压出滤膜，从针管压出的溶液就是无菌溶液。 紫外线和熏蒸灭菌（空间） (1)紫外线灭菌在接种室、超净台上或接种箱里用紫外灯灭菌。 紫外线灭菌是利用辐射因子灭菌，细菌吸收紫外线后，蛋白质和核酸发生结构变化，引起细菌的染色体变异，造成死亡。 紫外线的波长为 200～ 300nm，其 17 中以 260nm 的杀菌能力最强，但是由于紫外线的穿透物质的能力很弱，所以只适于空气和物体表面的灭菌，而且要求距照射物以不超过 120 cm为宜。 (2)熏蒸灭菌用加热焚烧、氧化等方法，使化学药剂变为气体状态扩散到空气中，以杀死空气和物体表面的微生物。 这种方法简便，只需要把消毒的空 间关闭紧密即可。 常用熏蒸剂是甲醛，熏蒸时，房间关闭紧密，按5～ 8ml/m3 用量，将甲醛置于广口容器中，加 5 g/m3 高锰酸钾氧化挥发。 熏蒸时，房间可预先喷湿以加强效果。 冰醋酸也可进行加热熏蒸，但效果不如甲醛。 化学消毒剂的种类很多，它们使微生物的蛋白质变性，或竞争其酶系统，或降低其表面张力，增加菌体细胞浆膜的通透性，使细胞破裂或溶解。 一般说来，温度越高，作用时间越长，杀菌效果越 好。 另外，由于消。