生物工程毕业设计论文-毒死蜱降解微生物的筛选及其生长条件的研究

生物工程毕业设计论文-毒死蜱降解微生物的筛选及其生长条件的研究内容摘要：

土壤和水体中化学农药的去毒与净化是治理化学农药污染的有效方法 [8]，并已显示出良好的应用前景。 有机磷农药的微生物降解途径 有机磷农药被微生物降解是它们在土壤中转化的重要途径，有机磷农药的微生物降解主要存在以下过程 ： 一种是微生物本身含有可降解该农药的酶系基因，当有机磷农药进人土壤后，微生物马上能产生降解有机磷农药的降解酶，在这种情况下，降解菌的选育较为容易 ； 另一种是微生物本身并无可降解该有机磷农药的酶系 ，当农药进人环境以后，由于微生物生存的需要，微生物的基因发生重组或改变，产生新的降解酶系。 YonezawwaY(1979)[8]等认为当微生物对有机化合物的降解作用是由其细胞内的酶引起时，微生物降解的整个过程可以分为三个步骤 ： 首先是化合物在微生 7 物细胞膜表面的吸附，这是一个动态平衡 ； 其次是吸附在细胞膜表面的化合物进入细胞膜内，在生物量一定时，化合物对细胞膜的穿透率决定了化合物穿透细胞膜的量 ； 最后是化合物进入微生物细胞膜内与降解酶结合发生酶促反应，这是一个快速的过程。 有机磷农药通常含有 P=S 键和 P=O 键，有些 有机磷农药 (如甲胺磷 )还含有 PN 键。 当有机磷农药进人土壤环境，土壤中的微生物产生相应的酶，在这些酶的作用下，上述化学键被打断，使有机磷农药被降解。 Mageong(1994)[8]等报道大肠杆菌产生的磷酸三酯酶能打开甲胺磷的 PS键。 Bello Ramirez A M(2020) [9]等也证实氯代过氧化物酶可以切断有机磷农药中的PS 键。 阮少江等 (2020) [10]推测甲胺磷的微生物降解是甲胺脱氢酶打断 PN 键开始的。 有机磷农药对土壤中的活性酶也存在抑制性，抑制程度的大小随着外界环境的变化而变化，而且 不同种类的有机磷农药对酶的影响也是不同的，但反过来，有机磷农药对酶的活性也具有一定的刺激作用，朱南文等 (1996) [11]发现在施用甲胺磷 14d 内，甲胺磷对土壤中酸性磷酸酶、中性磷酸酶和碱性磷酸酶呈一定的抑制作用，而在 4d 以后，对酶的抑制性消失，甚至出现了刺激效应。 郭明等 (2020) [12]发现在 7d 以内，氧化乐果和久效磷对土壤中的脱氢酶产生抑制作用，在 9d以后，对脱氢酶的抑制作用消失，反而有一定的激活作用。 这可能是因为当有机磷农药开始加人土壤后，农药的浓度高对土壤中微生物生长和活动产生抑制作用，从而 对微生物体内酶和土壤中的游离酶产生抑制作用，但有机磷农药能促进土壤中一些微生物 (如细菌、真菌和放线菌等 )的生长并抑制一些微生物 (如固氮菌 )的生长，所以随着细菌、真菌和放线菌数量的增多以及农药浓度的减少，酶的活性也就提高了。 有机磷农药在土壤中的微生物降解还受到农药浓度的影响，当农药浓度过高，对微生物的毒性越大，可使微生物的数量显著下降。 而当农药浓度过低时，由于微生物生长的碳、氮源不足，抑制了微生物的生长，从而抑制有机磷农药的微生物降解，实验证实乐果浓度在 %时微生物降解的效果最好，而在 %和%则呈下降趋势。 王永杰等 (1999) [13]也推断在自然环境中，有机化合物的浓度极低可能是限制其生物降解的一个主要因素。 一种有机磷农药可被多种微生物降解；同时，一种微生物也可对多种有机磷农药进行降解。 因此，土壤中的微生物数量和种类对于有机磷农药的降解有着重要的作用。 8 有机磷农药微生物降解的研究进展 自上世纪 70 年代开始，人们就发现有些土壤微生物对有机磷农药具有降解作用。 到目前为止已发现的有机磷降解微生物包括细菌、真菌、放线菌和藻类。 进一步研究发现这些微生物之所以能降解有机磷农药是因为它们能分泌一 种能水解磷酸酯键的酶，即后来研究的有机磷农药降解酶。 20 世纪 80 年代， Munnecke等 (1980)发现有机磷农药降解酶比产生这类酶本身，特别是对低浓度的农药。 因此，人们的思路从应用微生物菌体净化农药污染转向利用有机磷农药降解酶。 随着分子生物学的发展，对有机磷农药降解酶的研究目前已进入到分子水平，数种微生物来源的有机磷农药降解酶已得到分离纯化并进行了较深入的生理生化研究。 其中两株对硫磷降解菌 Flavobacterium (Walter ,1980)和 Pesudomonas diminuta GM( McDaniel,1988)的降解酶得到了深入细致的研究，分离得到了降解酶基因（ opd），比较发现两者基因具有很强的同源性，并且这两株菌的降解酶基因都定位于细菌内的大质粒上。 由于这两种酶本身就是同源性很高的酶，所以二者在空间结构上极其相似。 通过底物类似物亲和晶体的 x－衍射的方法，国外的学者们研究了酶的三维构象，发现酶是同源二聚体，其催化中心具有 2 个 Zn2+离子，它们为酶的几个重要的氨基酸残基（ His55,His57,Lys169,Asp301,His201,His230）所围绕，形成双核金属催化中心，在这里金属离子结合的羟离子可以亲核攻击底物的亲核性磷原子，促进水解反应的发生，从而使农药毒性降低。 最近又有报道， 的 opd 基因两侧基因簇有转座子特性。 Munnecke 等分离到的有机磷农药降解酶对试验用的甲基对硫磷、对硫磷、二嗪农、毒死蜱等 7 种有机磷农药均能有效降解，在 22℃ 时降解效率比化学降解快 10002450 倍，且该酶不为农药及农药制剂中溶剂所抑制，对环境条件有较宽的忍受范围。 1991 年， Defrank 等从一 株嗜盐细菌中纯化得到一种有机磷农药降解酶，分子量 60KD，可被 Mg2+和 Co2+激活，对含磷氟键的有机磷化合物作用较好，对含磷氧键的有机磷化合物作用不好。 与 OPH 相比， OPDA 降解二甲基底物的速度更快，但对于二乙基底物的水解速度无关。 2020 年， 等 ( ,2020)从澳大利亚分离到一株降解乙硫磷的微生物，分 9 离提纯了降解酶，并对它的酶动力学进行了初步研究。 这些研究使得关于有机磷农药降解酶的认识得到进一步深入，酶学机理得到进一步了解。 我国关于有机磷农药降 解酶的研究起步较晚，但近年也已取得了较大进步。 李顺鹏等 (2020) [13]分离了多株有机磷降解菌，并对其进行了详细研究，分离获得了多种有机磷农药降解酶的基因，实现了融和表达，并对酶学性质进行了分析。 从菌株 M6 中分离提纯的有机磷农药降解酶经分析发现，其 C－末端含有 6 个寡聚组氨酸，水解甲基对硫磷时，最适 ，最佳反应温度 15℃ ； Mn2+、 Zn2+、Cu2+可使酶活性增加 15％－ 20％， Ca2+、 Mg2+微弱的促进酶的作用， Ni2+对酶活性几乎无影响； 1mmol/+ 几乎不影响酶的 活性，而 10mmol/L +对甲基对硫磷水解酶有较强的抑制作用。 陈亚丽 (2020)[14]等从一株假单胞杆菌 WBC3 中分离到降解甲基对硫磷的有机磷农药降解酶，已进行 X－衍射分析其三维结构。 从曲霉菌中分离纯化出有机磷降解酶，此酶对有机磷农药乐果具有很好的降解作用，它的最适反应温度 45℃ ，最适反应 ，对热稳定，并能在 pH610 范围保持活性，重金属、 Cu2+对该酶有明显的促进作用，而 SDS对其具有抑制作用，这是首例来自真菌的磷酸三酯酶。 应用有机磷农药降解酶就必须解决一个关键性的问题 ——如何工业化、廉价、快速生产有机磷农药降解酶。 有机磷农药降解酶在原始天然菌株中含量太低，难以进行大量生产，生产成本昂贵。 这是目前世界上还未有商品化生产的有机磷农药降解酶产品以及在生产实践上推广应用的关键原因。 近年来，随着分子生物学及基因工程的发展，有机磷降解酶的基因工程的研究也取得了一定发展，为其大规模廉价生产奠定了基础。 降解有机磷农药的微生物种类 综述有关文献发现 [18,19]： (1)能够降解农药的有 细菌，真菌，放线菌藻类，其中，细菌本身在生理生化具有多种适应能力以及容易诱发突变，因此，这使得细菌在降解农药中占主导地位。 (2)同样的菌株能够降解不同的农药，一种农药同时可以被不同菌株降解。 表 [20]为部分菌种和其能够降解的农药。 10 表 部分菌种和其能够降解的农药 Table Some parts of pesticides degraded strains and species of pesticides 微生物的种类 有机磷农药种类 细菌 芽孢杆菌属 (Bacillus) 甲胺磷、苯硫磷、氧乐果、对硫磷、敌敌畏、甲基对硫磷、 节细菌属 (Arthrobacter) 马拉硫磷、二嗪农 假单胞菌属 (Pseudomonas) 马拉硫磷、甲拌磷、甲胺磷、敌敌畏、乐果、对硫磷、甲基对硫磷 黄单胞杆菌属 (Canthomonus) 对硫磷、杀螟松、杀螟睛 黄杆菌属 (Flavobacterium) 对硫磷、甲基对硫磷、马拉硫磷、毒死媲 短杆菌属 (Brevibacterium) 对硫磷、甲基对硫磷 硫杆 菌属 (Ihiobacillus) 甲拌磷 极瘤细菌属 (Rhizobium) 马拉硫磷、对硫磷 固氮极毛杆菌属 (Azotomonus ) 对硫磷、毒死媲 不动杆菌属 (Aciobacterium ) 甲胺磷 动性球菌属 (Planococcus) 水胺硫磷 真菌 木霉属 (Trichoderma) 敌敌畏、对硫磷、马拉硫磷 根霉属 (Rhizopus) 地虫磷、溴硫磷 曲霉属 (Aspergillus) 敌百虫、溴硫磷、地虫磷、乐果、甲胺磷 青霉属 (Pinicielium) 地 虫磷、敌百虫、对硫磷 酵母属 (Saccharomyccs) 敌敌畏、对硫磷、马拉硫磷 镰刀菌属 (Fusarium) 敌百虫 藻类 小球绿藻属 (Chlorolla) 甲拌磷、对硫磷 放线菌 链霉属 (Streptomyces) 二嗪农 11 第二章 有机磷农药降解 菌 的筛选及生长条件的研究 试验材料 培养基 富集培养基： (1)细菌： 牛肉膏 3 g，蛋白胨 10g， NaCl5g，琼脂 1520g，蒸馏水l000ml， pH 值 ～。 (2)真菌：马铃薯 200g，葡萄糖 20g，琼脂 1520g，蒸馏水 l000 ml，自然 pH[21]。 无机盐培养基 : K2HPO4 0. 2g， KH2PO4 0. 8g ， MgSO47H2O 0. 2g ， CaSO42H2O 0. 1g ， Na2MoO42H2O ， FeSO47H2O 0. 005g ， (NH4)2SO4 1. 0g ， 蒸馏水 1000mL,调节。 选择培养基 (琼脂平板 )：在富集培养基的基础上加入 100mg/L的毒死蜱。 样品及试剂 土壤：土样取自蓝天实业辛硫磷车间附近。 试剂如表 主要仪器 及设备 主要仪器及设备如表 试验方法 菌种的分离及筛选 采用固体培养基富集培养法，称取土样 1 g于 5mL无菌水中振荡混匀制成菌液。 将上述菌液分别均匀地涂布在细菌和真菌固体富集培养基上，培养基中毒死蜱的浓度为 60mg/L，置于 30℃ 恒温培养箱中培养。 2天后，挑取有明显透明圈的菌落划线转移至农药浓度提高的新鲜富集培养基中，培养 2天，连续 5次转接直至富集培养基中农药浓度提高到 480mg/L。 最后，接种斜面，编号保存。 12 表 试剂 Table The reagents 试剂名称 生产厂家 牛肉膏、蛋白胨 梁山科泰生物制品有限公司 葡萄糖、蔗糖 广东汕头市西陇化工厂 琼脂条 福建省石狮市琼脂副食品加工厂 对二甲氨基苯甲醛、 FeSO 对硝基苯酚 天津市博迪化工有限公司 KH2PO4 、 Na2MoO4， CaSO42H2O 西安化学试剂厂 MgSO47H2O、 (NH4)2SO4 、 K2HPO4 西安化学试剂厂 NaCl、 NaOH、 HCl、 95%乙醇 西安化学试剂厂 无水乙醇、甲醇、丙酮 西安化学试剂厂 毒死蜱 美国陶氏益农公司 30%H2O2 天津市化 学试剂六厂 溴百里香酚蓝 上海慨洋生物技术有限公司 尿素、柠檬酸钠 天津市瑞金特化学品有限公司 明胶 青岛化学试剂厂 甲基红 天津市东方卫生材料厂 乙醚、硫代硫酸钠 西安化学试剂厂 半乳糖 上海试剂二厂 表 仪器及设备 Table Instruments and equipment 仪器名称 及型号 生产厂家 SWCJ1G型单人净化工作台 苏州净化设备有限公司 LRH250Ⅱ 生化培养箱 广东省医疗器械厂 LDZX75KB立式压力蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂 HZQF全温振荡培养 哈尔滨市东联电子技术开发有限公司 实验室 pH计 梅特勒 托利多仪器（上海）有限公司 722光栅分光光度计 上海精密科学仪器有限公司 XSZ2GA光学显微镜 重庆光电仪器有限公司 13 菌种的鉴定 2． 2． 2． 1 形态特征 （。