透明质酸的生产工艺

透明质酸的生产工艺内容摘要：

6%~0. 8%)，但 由于 所用 的原 料为 人脐带 ，所 得 透 明 质酸 精品 作为 眼科 手术 用粘 弹辅 助剂 时 ,引 起抗 原反 应的 可能 性较 小。 三 、 以 动物 眼玻 璃体 为 原料 的制 备工 艺 [3,7,8] （ 一 ） 工 艺路 线 （ 二 ） 工 艺过 程 1．提取 将冷 冻的 牛、猪 或羊 眼球 解冻 ，剥出 玻璃 体，融化 后离 心，分 出上 清，加入 倍 体 积 的 丙酮 沉淀。 8h 后 离心 ，所 得沉 淀加 入到 1mol/L 氯 化钠 溶液 中， 搅拌 提取 4h，离 心。 2． 除 蛋 白 质上 清液 在低 温下 加入 冷的 5%三 氯乙 酸， 搅匀 ，立 即离 心分 出上 清液 ，用5m ol/L 氢氧 化钠 溶液 调 pH 值至 中性。 3． 粗 品 沉 淀将 中性 上清 液倒 入 2 倍 体积 95%乙醇 中， 分出 沉淀。 4．溶 解、吸附 除杂 质将 沉淀 溶于 ，加 入处 理好 的漂 白土 搅拌吸附 2h， 离心 收 集 上清 液。 5． 络 合 沉 淀向 上清 夜内 加入 等体 积的 1%CPB 溶 液， 得 HACPB 沉 淀。 放置 12h 后离心 ， 收 集 沉淀。 6． 解 离 沉 淀洗 涤后 于 ， 抽滤。 7．沉 淀、干燥 ：将 滤液 倒入 3 倍体积 95%乙 醇中 ，分 出沉 淀。 沉淀 经乙 醇 、丙 酮脱水 ，放 于 有 五 氧化 二磷 的真 空干 燥器 内干 燥， 得玻 璃酸 钠精 品。 （ 三 ） 工 艺说 明与 讨论 1．以 动物 眼玻 璃体 为原 料制 得的 透明 质酸 ，其质 量较 以雄 鸡冠和 人脐 带为 原料 者差 ，相对 分 子 质 量 Mr 较小 ，一 般不 适于 作注 射剂 使用。 2．吸 附除 杂质 步骤 ，尚可 选用 类 似 吸附 剂。 天然 矿物 质吸 附剂 常因 生产 厂或 同一 厂批次不 同在 吸附 性能 上有 差异 ，其 预处 理方 法也 很重 要，要 根据 实际 情况 实验 研究 来确 定具体操 作 方 法。 3． C PB 与 CPC 的 性能 基本 相同 ，两 者在 透明 质酸 的生 产中 可相 互代 用。 四 、 细 菌发 酵法 生产 工 艺 （ 一 ） 工 艺路 线 [10~12] （ 二 ） 工 艺过 程 1）摇瓶 种子 液的培 养取 斜面 菌种 ，接 种于 装有 灭菌培 养液 400ml 的 1L 锥 形瓶 中， 37℃培养 12~16h，光 镜 观察 菌体 生长 良好 ，无杂 菌污 染 ，即 可接 种于 种子 罐中。 培养 液配方 ：蛋 白胨 10g、牛 肉浸膏 5g、酵 母膏 5g、葡 萄糖 5g、磷 酸 氢二钾 2g、硫 酸镁 0. 3g，加水溶 解 至 1L， 115℃ 灭菌 30min。 2）种 子罐 种子 液的 培养 按摇 瓶种 子液 的配 方配 制培 养液 100L，加 入种 子罐 中，通蒸汽加热， 115℃ 灭菌 30min。 冷 却至 37℃ ，用 火焰接 种法 ，将摇 瓶种 子液 接种 于种 子罐中 ，通 气 量 50L/min， 搅拌 120rpm， 37℃ 培养 12~16h。 光 镜观 察菌 体生 长良 好， 无杂 菌污 染 ， 即 可待 接种 于发 酵罐 中。 3） 发 酵 按 摇瓶 种子 液配 方， 将葡 萄糖 含量 提高 到 5%， 配 制发 酵培 养液 1000L， 加入1. 4m 3 发酵 罐中 ,通入 蒸汽 加热 ,115℃ 灭菌 30min。 冷却 至 37℃ 后 ，将 种子 罐中 的种 子液 通 过 移 种管 道移 至发 酵罐 中， 维持 通气 量 500~600L/min， 搅 拌转 速 120rpm， 37℃发酵 40~46h。 在发 酵过 程中 ，发 酵液 的 pH 值不 断下 降， 加 5mol/L 氢氧 化钠 溶液 ，调pH ~。 发酵 后期，葡萄 糖浓 度下 降至 %以下 ,pH 值 下降 很慢 或不 再下降 时 ,即为发 酵 终 点。 4）下 游分 离纯 化发 酵结 束 ,用 三氯 乙酸调 ~ ,板 框 过滤 除菌 体 ,滤液 用稀 氢氧化钠调 ~,加三 倍体积 95%乙醇 ,沉 淀出透 明质 酸。 沉淀 用发 酵体 积的 氯 化 钠 水 溶液 溶解 ，加 入 %的 活性 炭， 搅拌 吸附 1h。 过 滤， 滤液 在搅 拌下 ,加 入过 量的 1%CPC 水 溶液 与滤 液中 的透 明质 酸发 生络 合沉 淀 ,静置 使沉 淀下 沉 ,虹 吸出 母液 ,加入0. 1m ol/L 氯 化钠 液洗 涤沉 淀两 次。 沉淀 于发 酵体 积的 夜 ,过滤 ,滤 液加 三倍 体积 乙醇 沉淀 ,沉 淀用 乙醇 和丙 酮脱 水 ,用 旋转 式真 空 干 燥器 进行 干燥 ,得 透明 质酸 钠。 （ 三 ） 工 艺说 明与 讨论 1937 年， Kendall 等 [12]就 发 现链 球菌 可产 生透 明质 酸， 许多 人对 此进 行了 研究。 链球 菌属 的多 种细 菌具 有荚 膜 (见图 31 和图 32)，这 种荚 膜的 主要 成分 就是 透明质酸。 链球 菌在 生长 过程 中，荚膜 的产 生有 几种 不同 的情 况，有的 菌株 在整 个生 长期 都有荚膜 ，有的 在对 数生 长期 的前 段产 生，后 段消 失，或 稳定 期消 失，有 的根 本不 产生 荚膜。 进一 步的 研究 发现 这与 菌种 是否 产生 透明 质酸 酶有 密切 关系，事实 上目 前一 部分 商品 透明质酸 酶 就 是 用链 球菌 发酵 制得 的， 荚膜 的消 失是 由 于 被酶 解了。 MacLennan[13]根 据是 否产 生 透 明 质酸 和透 明质 酸酶 ，将 具有 荚膜 的链 球菌 C 组分 为三 类： 1） 只产 生透 明质 酸，不 产生 透明 质酸 酶； 2）透 明质 酸和 透明 质酸 酶都 产生； 3）只 产生 透明 质酸 酶，不 产生透明 质酸。 因此 ，。