国家高技术研究发展计划(863计划)课题中期执行情况报告

国家高技术研究发展计划(863计划)课题中期执行情况报告内容摘要：

）。 青枯雷尔氏菌强致病力菌株与无致病力菌株最后的鉴别方法为利用番茄组培苗回接，统计发病率（图 13）。 3青枯雷尔氏菌无 致病力菌株转 GFP基因 为了观察青枯雷尔氏菌无致病力菌株侵染植株的过程，对其进行绿色荧光蛋白（ GFP）基因转化，转化条件：质粒 pUTgfplux（ miniTn5）；培养基 LB培养基以及含有 50 μg/mL卡那霉素的 LB培养基。 仪器 Bio－ Rad Gene Pulser II Leica MZ12（图 14）。 转化后青枯雷尔氏菌无致病力菌株在荧光显微镜下显示出绿色光，表明转化成功（图 15）。 比较转化 GFP前后的青枯雷尔氏菌无致病力菌株生物学特性，结果表明，其对通气量要求无差异（图 16），对初始 pH要求无差异 （图 17），对温度的适应无差异（图 18），生长速度无差异（图 19）。 同时通过 PCR检测到 GFP基因的存在。 10 图 14青枯雷尔氏菌 GFP转化质粒构建 图 15青枯雷尔氏菌 GFP转化 图 16GFP转化后青枯雷尔氏菌对通气量要求相同 图 17GFP转化后青枯雷尔氏菌对 pH要求相同 图 18GFP转化后青枯雷尔氏菌对温度要求相同 图 19GFP转化后青枯雷尔氏菌生长速度相同 4青枯雷尔氏菌无致病力菌株侵染特性 利用青枯雷尔氏菌转 GFP无致病力菌株侵染番茄，可以在叶、茎、根部检测到 GFP菌株的存在，用番茄芽，直接在紫外灯下可以见到整个芽发绿色光（图 20）。 对侵染特性研究表明，最佳接种浓度为 102以上（图 21），最佳接踵温度为 22℃ 以上（图 22），最佳接种方法为灌根和剪叶法（图 23）。 利用利用青枯雷尔氏菌转无致病力菌株（ 64）生产出免疫抗病接种剂 鄂鲁冷特（图 24），用于接种番茄盆栽苗，接种鄂鲁冷特后 3天，再接种强致病力菌株，对照采用未接种鄂鲁冷特的组培苗，同时接种强致病力菌株， 7天后，前者发病率为 0，后者发病率为 100%（图 25），表明免疫抗病接种剂 鄂鲁冷特具有很好的免疫抗病效果。 11 图 20青枯雷尔氏菌转 GFP无致病力菌株接种 图 21青枯雷尔氏菌转 GFP无致病力菌株接种浓度 图 22青枯雷尔氏菌转 GFP无致病力菌株接种温度 图 23青枯雷尔氏菌转 GFP无致病力菌株接种方法 图 24青枯雷尔氏菌转无致病力菌株免疫接种剂 图 25青枯雷尔氏菌转 GFP无致病力菌株接种抗病 5青枯雷尔氏菌无致病力菌株免疫接种剂的生产工艺 对青枯雷尔氏菌转无致病力菌株的生产工艺进行了研究，提出了菌种制备方法，发酵培养基配方、发酵控制工艺、浓缩提取工艺、基质干燥工艺、产品配置工艺、产品质 量标准、产品保存条件、产品效果检测方法等，生产出青枯病免疫抗病接种剂 鄂鄂 鲁鲁 冷冷 特特 （图 26） 12 图 26青枯病免疫抗病接种剂 鄂鄂 鲁鲁 冷冷 特特 生产工艺 6青枯雷尔氏菌无致病力菌株接种免疫抗病特性 用免疫接种剂 鄂鲁冷特 100倍液浸种番茄，用清水对照，而后将番茄种子发芽，苗床育苗，田间移栽， 25天后观察苗期青枯病发病率，处理组发病率低于 3%,对照组发病率高于 38%，说明免疫接种剂 鄂鲁冷特对番茄苗期青枯病有较好的控制能力（图 27）。 用免疫接种剂 鄂鲁冷特 300倍液对茄子苗进行灌根，用清水对照，处理面积 4亩，在茄子 结果期调查发病率，使用免疫接种剂发病率低于 8%，不使用免疫接种剂发病率高于 47%，防治效果达 83%（图 28）。 图 27免疫接种剂 鄂鲁冷特对番茄青枯病防效 图 28免疫接种剂 鄂鲁冷特对茄子青枯病防效 7小结与讨论 提出了青枯雷尔氏菌脂肪酸型 ,建立了判别模型 ,准确率 93%。 建立了青枯雷尔氏菌分化的细菌色谱鉴定体系。 设计了 PhcA基因引物 , 鉴别青枯雷尔氏菌强株、弱株、过渡型株。 完成了青枯雷尔氏菌 GFP基因转化。 生产出青枯病免疫接种剂 ,测定了免疫接种条件 ,初步实验了防病效果。 后续研究，植物免疫机理 研究，植物非特异性免疫指标测定，包括接种无致病力菌株后植株酶的变化， phcA基因探针， EPS测定等等。 无致病力菌株伴生菌的研究，强无致病力菌株体内竞争研究。 植物作为无致病力菌株生物反应器的生长条件研究，包括生理小种、寄主、部位、生物期、生长条件等。 植物免疫接种剂生产工艺、制剂技术、保存技术、质量标准、使用技术等。 13 （二） 作物枯萎病 原菌 的遗传分化及其生物防治研究 1 作物枯萎病 原菌 的遗传分化 枯萎病是由致病性镰刀菌引起的一种土传真菌病害，该病在福建省内发病严重，在瓜类作物（西瓜、黄瓜、甜瓜等）、香蕉、花生等 作物上均有发生，导致减产 20%～ 30%，严重的的田块可达 50%～80%，甚至绝产。 所以枯萎病成为福建省乃至全国作物生产发展的主要限制因子。 本研究室从发生枯萎病的植株上采集、分离了一批枯萎病菌，经常规的形态鉴定及分子鉴定，发现它们属于镰刀属的3 个不同小种：尖镰孢、茄镰孢和串珠镰孢。 对这 3 个种的 ITS序列分析，结果表明，这 3 个种之间的 ITS序列差异较大，但各个种种内菌株的 ITS序列相同或只有 1 至 2 个碱基的差异。 为了分析各个种种内菌株间的遗传多样性，我们采用了 RAMS标记， RAMS标记 ]具有微卫星分析的稳定性和 RAPD分析的普遍性，重复性高，正逐渐应用在病原真菌的研究中。 供试的 43株尖镰孢菌见表 1， 30株串珠镰孢菌见表 2， 8株茄镰孢菌见表 3。 从 27个 RAMS引物中筛选 10个扩增条带清晰、多态性强的引物。 引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。 PCR 反应的每个样的总体积为 25μL。 反应体系： 10xPCR Buffer for Taq Plus ， Taq polymerase ， 10mmol/L dNTP ， 引物 (10pmol) ， Template ， Sterilized water。 反应程序为： 94℃ ， 10min，接着 45 个循环，每 1 循环的程序为 94℃ 变性 30s， 57℃复性 45s， 72℃ 延伸 2min，最后 72℃ 延伸 10min。 扩增结束后，取 5μL PCR产物进行 %琼脂糖凝胶电泳以检查扩增结果。 然后在 Gel Doc 2020 凝胶成像系统（ BioRad）上观察并贮存图像。 参照 RAMS扩增结果的琼脂糖凝胶电泳图谱，每一条 DNA带均为一个分子标记，并代表一个引物结合位点。 根据各分子标记的迁移率及其有无统计所得位点的二源数据：有带计为“ 1”，无带 计为“ 0”，强带和弱带均计为“ 1”，组成“ 01”数据表。 将所得数据输入 DPS数据处理系统，采用 NeiLi（ Czekanows）聚类距离中的类平均法 UPGMA(unweighted pair group mean average)进行聚类，并自动生成各供试菌株的遗传聚类图和相异系数表。 为反映 RAMS标记的多态性，统计各引物的多态条带百分率。 表 1 尖镰孢菌 菌株 N0 Strain Number Host Strain Location 1 121 黄瓜 漳州 诏安 2 146 不详 3 283 盆栽苗 4 129 甜瓜 福州永泰 5 130 福州永泰 6 131 福州永泰 7 144 福州义序 8 134 西瓜 福州永泰 9 137 福州 永泰 10 140 福州永泰 11 141 福州永泰 12 219 福州永泰 13 644 FusariumYuxi2 福清渔溪 14 173 瓠瓜 福清 15 147 辣椒 漳州诏安 16 166 福清 17 865 莆田 18 152 豇豆 泉州 19 370 香蕉 漳州 20 387 漳州 21 389 漳州 14 22 391 漳州 23 392 漳州 24 393 漳州 25 820 花生 泉州惠安 26 821 泉州惠安 27 824 泉州惠安 28 831 泉州惠安 29 833 泉州惠安 30 834 泉州惠安 31 836 泉州 惠安 32 841 泉州惠安 33 842 泉州惠安 34 846 泉州惠安 35 847 泉州惠安 36 855 泉州惠安 37 856 泉州惠安 38 857 泉州惠安 39 858 泉州惠安 40 860 泉州惠安 41 861 泉州惠安 42 863 泉州惠安 表 2 串珠镰孢菌 菌株 N0 Strain Number Host Strain Location 1 120 黄瓜 漳州诏安 2 122 漳州诏安 3 123 漳州诏安 4 124 漳州诏安 5 128 甜瓜 福州永泰 6 132 福州永泰 7 133 西瓜 福州永泰 8 135 福州永泰 9 160 （ 31） 福州永泰 10 163 （ 08） 福州永泰 11 174 瓠瓜 福清 12 165 辣椒 福清 13 709 宁夏 14 829 莆田 15 170 豇豆 福清 16 171 福清 17 380 香蕉 漳州 18 382 漳州 19 383 漳州 20 390 漳州 21 814 花生 FH. 36202006082601 泉州惠安 22 815 FH. 36202006082602 泉州惠安 23 819 泉州惠安 24 822 泉州惠安 25 823 泉州惠安 26 838 泉州惠安 27 840 泉州惠安 28 843 泉州惠安 29 845 泉州惠安 30 859 泉州惠安 表 3 茄镰孢菌菌株 N0 Strain Number Host Strain Location 15 1 176 番茄 福清 2 177 福清 3 832 花生枯萎病植株 泉州惠安 4 848 花生烂果病荚果上新长出的幼苗 泉州惠安 5 849 泉州惠安 6 850 泉州惠安 7 851 花生烂果病荚果 泉州惠安 8 853 泉州惠安 PCR扩增结果 图 3分别是部分 RAMS引物对尖镰孢、串珠镰孢、茄镰孢菌的扩增结果，从图中可看出各样品的扩增片段大小介于 2003000bp 之间，各菌株的扩增带型具有一定差异性，说明 RAMS 标记适用于镰刀菌的遗传多样性分析。 图 1 引物 R24 对尖 镰孢菌扩增结果 图 2 引物 R24 对串珠镰孢菌扩增结果 图 3 引物 R22（ A）和引物 R24（ B）对茄镰孢菌扩增结果 聚类分析 尖镰孢菌的聚类分析 从系统聚类分析所生成的树状图谱（图 4）可以明显看出，以 ，供试 42个 尖镰孢菌 菌株可以聚为 9个类群 ，第 I组群为 黄瓜上一株非致病力菌株（ 121） ；第 II组群 包括：甜瓜上 2个菌株（ 129和 130）、豇 豆上 1个菌株（ 152）、花生上 15个菌株、西瓜上 6个菌株 ；第 III组群 16 为 辣椒作物上分离的 3个菌株 ； 第 Ⅳ 组群 为 1株黄瓜上分离菌株（ 283）和 1株甜瓜上分离的菌株（ 131）；第 Ⅴ 组群 为花生上分离的 3个菌株； 第 Ⅵ 组群 为 1株黄瓜上分菌株（ 146）； 第 Ⅶ 组群 为 6株香蕉上分离的菌株； 第 Ⅷ 组群 为 1株甜瓜上分离的菌株（ 144）； 第 Ⅸ 组群 为 1株瓠瓜上分离的菌株（ 173）。 图 4 尖镰孢菌聚类图 串珠镰刀菌聚类分析 30 株串珠镰刀菌的聚类分析如图 5 所 示，以 的遗传相异系数为临界值，供试 30 个串珠镰孢菌菌株可以聚为 8 个类群，第 I 组群为黄瓜上 4 个菌株和西瓜上 1 个菌株；第 II 组群为辣椒上 2个菌株（ 709 和 829）；第 III 组群为甜瓜上 1 个菌株和瓠瓜上 1 个菌株；第 Ⅳ 组群为西瓜上分离 3个菌株；第 Ⅴ 组群包括： 4 个香蕉上分离菌株（ 38 380、 38 390）、辣椒上 1 个菌株（ 165）、豇豆上 2 个菌株、花生上分离的 1 个菌株；第 Ⅵ 组群为花生上分离的 7 个菌株；第 Ⅶ 组群为花生上分离的 2 个菌株；第 Ⅷ 组群为 1 株甜瓜上分离的菌株（ 132）。 17 图 5 串珠镰刀菌聚类分析 图 6 茄镰刀菌聚类分析 茄镰刀菌聚类分析 以 ， 8个茄镰孢菌 菌株可以聚为 2个类群 ，第 I组群为 辣椒上分离的。