人类精液检验与处理实验室手册第五版下

人类精液检验与处理实验室手册第五版下内容摘要：

半自动化的形态学模板。 CASA 在评价精子活力、密度、形态方面 较人工方法具有两个有点：高精确性和提供精子动力学的量化数据（成熟细胞的特点：前向运动和高的活动性）。 一些研究提示， CASA 对前向运动精子密度和活动特征的评估结果与体外受精率和受精时间有很好的相关性 (Liu et al.,1991a。 Barratt et al., 1993。 Irvine et al., 1994。 Krause, 1995。 Donnelly et al., 998。 Larsen et al., 2020。 Garrett et al., 2020。 Shibahara et al., 2020)。 利用 CASA 来检测精液活动力和密度的方法分别在 和 小节中介绍，而 小节则阐述了计算机辅助形态学分析的相关问题。 应用 CASA 评价精子密度 CASA 仪器最好用于精子活力的分析，因为它能够检测到活动的细胞。 活力百分比的估计值是不可信的，因为这个数值是在计算不活动的精子数目的基础上得出的，而一些颗粒碎片也可能被混淆其中。 现在已知很多因素都影响 CASA 仪器的使用，例如样品的制备、读数率、精子密度及计数池的深度 (Davis amp。 Katz, 1992。 Mortimer, 1994a, b。 Kraemer et al., 1998)。 如果遵循正确的步骤，可得到可信的和可重复的结果 (Davis amp。 Katz, 1992)。 可查阅使用 CASA 参考指南。 用 CASA 分析精子运动参数时，每个标本中至少追踪 200 个活动精子。 这将需要检测更多数量的精子。 如果想把精子按运动能力分类或在一份标本中做变异性的其它分析，至少需要追踪 200 个，如果可能最好 400个活动精子。 实验设计应力图使每份标本中被分析的精子数目标准化。 CASA 仪器应与可进行数据处理和统计分析的计算机软件结合起来。 许 多运动参数的标本分布是非正态分布的，因此提倡用中位数而不是用平均值去总结每个运动参数的中心趋势。 有必要在进行一定统计学分析之前只对单一精子参数进行数学转换。 程序 每个 CASA 设备的正确安装对于维持设备良好的性能是至关重要的，并且有赖于预期的使用。 制造商提供了适宜的参数，但使用者必须检查每个设备的运行是否达到其所要求的重复性和可靠性。 必须使用适当的质量控制材料，如录像磁带（见附录 7， ）以下作者已经对一般情况下的 CASA 装置进行了讨论 (Davis amp。 Katz, 1992。 Mortimer, 1994b。 ESHRE, 1998)。 标本的制备 用于 CASA 的精液的采集和处理标准同第 2 章所述。 CASA 系统必须将样本保持在 37℃，因为精子运动参数具有温度敏感性。 在精液未稀释前检测精子活动特性和密度。 检测精子活动力，标本密度应控制在 2 106/ml 到 50 106/ml 之间 (Garrett et al., 2020)。 具有高密度 (如高于 50 106/ml)精子的标本，通常会增加碰撞的频率，并可能由此出现错误的结果。 在这种情况下，建议稀释标本，而同源精浆更适合。 16,000g 离心一部分精液标本， 6 分钟，去除精浆。 用无精子的精浆稀释原精液样本至其密度低于 50 106/ml。 一次性 200181。 m 深的计数池可以得到可靠的结果。 这是一个双池系统，两个计数池均应被充满并检测。 必须检测几个有代表性的视野：每个计数板检测 6 个视野（共 12 个视野）以得到可靠的结果。 每个计数池至少应该检测 200 个精子。 使用原理相同的质量控制，使活动力的评估标准化（见 ）。 可以直接分析标本，也可以用录像带记录方法。 分析录像（录像带、 CDROM 或 DVD）记录的结果可以实现标准化，并 按质量保证程序进行（见附录 7， 小节）厂家将对录像机的选择以及使精子头和背景产生最大反差的最适照明条件提出建议。 对于获得精确结果所需的追踪精子的时间目前尚有争议。 但追踪精子的时间至少是 1 秒，足以得到基本 CASA 检测精液的可靠结果 (Mortimer, 1994b)。 CASA 术语 CASA 系统检测的参数有一套标准的术语，说明见图。 VCL=曲线速度 (181。 m/s)。 精子头沿其实际的曲线，即在显微镜下见到的二维方式运动轨迹的平均速度。 检测细胞活力。 VSL=直线速度 (181。 m/s)。 根据精子头在开始检测时的位置与最后所处位置之间的直线运动的时间平均速度。 VAP=平均路径速度 (181。 m/s)。 精子头沿其空间平均轨迹移动的时间平均速度。 这个轨迹是根据 CASA 仪器中的算法对实际轨迹平整后计算出来的；这些算法因仪器不同而有所不同，故不同 CASA 系统的数值不能直接相比较。 ALH=精子头侧摆幅度 (181。 m)。 精子头沿其空间平均轨迹侧摆的幅度。 以侧摆的最大值或平均数值表示。 不同的 CASA 仪器用不同的算法计算 ALH，故不同 CASA 系统的数值不能直接相比较。 LIN=直线性。 曲线轨迹 的直线性。 VSL/VCL。 WOB=摆动性。 精子头沿其实际轨迹的空间平均路径摆动的尺度。 VAP/VCL。 STR=前向性。 空间平均路径的直线性。 VSL/VAP。 BCF=鞭打频率 (Hz)。 精子曲线轨迹越过其平均路径轨迹的时间平均速率。 MAD=平均移动角度（度）。 精子头沿其曲线轨迹瞬间转折角度的时间平均绝对值。 表 CASA 系统检测变量的标准术语 注：不同的 CASA 仪器用不同的数学运算方法计算多项运动参数。 目前所有仪器交叉测量结果的可比程度尚属未知。 应用 CASA 评估精子密度 应用荧光 DNA 染色 CASA 可准确检测活动精子的密度以及活动力的百分比，但需谨慎应用该技术 (Garrett et al., 2020)。 例如，如果使用一次性计数池，因为精子充满计数池时分布会不均匀，故评估不同位置的精子标本是重要的 (DouglasHamilton et al., 2020b)。 应用血细胞计数板验证是必要的。 可检测的精子密度为 2 106/ml50 10６ /ml 之间 (Garrett et al., 2020)。 精子密度在 50 10６ /ml 以上的需要稀释（ 见 小节）。 注释： CASA 仪器检测并计数荧光染色精子的头部。 没有显微的评价就没有其它方法知道精子是否完整（如头尾相粘）。 计算机辅助精子形态学评估 图像分析在评价精子形态方面，可能带来量化、客观性和可重复性的重大进展。 商业系统可用来量化精子头部和中段的形态，主段精子也有可能。 然而，精子尾部缺陷对运动的影响可以更直接地通过应用 CASA 检测活动力和运动状态。 CASA 系统通常可以将精子头和中段分为正常或异常，并且给出精子头和中段、头部椭圆和规则性以及依赖染色检测的顶体区的平均值和标 准差或中位数。 与人工系统相比，自动化系统更具客观性，精确度和重复性的潜力 (Menkveld et al., 1990)。 精确度和重复性不低于 7%(Garrett amp。 Baker, 1995)，这优于有经验的技术人员的手动评估。 计算机辅助精子形态学评估（ CASMA）结果的重现性和准确性，因为方法的不一致，比如焦距、照明、样品制备和染色的不一致，可能存在诸多问题 (Lacquet et al., 1996。 Menkveld et al., 1997)；正确的将精子头与精液碎片区分开存在技术上的困难，尤其在精子 浓度低时 (Garrett Baker,1995； Menkveld et al., 1997。 Coetzee et al., 1999a, b)。 自动化评价的本质意味着存在制备缺陷和人为影响时没有补救方法。 因背景底纹相对细胞染色的微小差异带来的结果的偏差可导致错误精子分类或无法确认精子细胞。 与人工形态学评价一样，程序和仪器必须标准化及质量控制，确保结果可比较、可信。 精子可以按照 小节介绍的方式处理，以减少 CASMA 记录背景的影响。 如果精子密度低（ 2 106/ml），需要离心浓缩标本，如 小节所述。 注意：离心可影响精子形态，采用必须记录。 两个研究已经提示在 CASMA 结果与生育力之间存在显著联系。 Coetzee 等（ 1999c）发现自动化的正常精子形态的结果可预测体外受精率和妊娠。 Garrett 等 (2020)发现精液中具有与透明带结合（ Z%）的头部形态特征的精子所占的百分比及直线速度（ VSL），与大样本的低生育力夫妇的自然妊娠率是有显著且独立的关系。 Z%和 VSL 与生育力间的关系显示是连续的，而且没有提示妊娠率不再提高的界限值。 很多大样本生育力结果的研究要求精制 CASA应用程序 以检测精子形态。 自动化系统可以为质量控制系统提供数据，但是仍然需要更多的研究证明其临床价值。 （沈阳菁华医院 许蓬译） 第 4 章 研究精子功能所用检测方法 当实施精子功能检验时，在射精 1 个小时之内将精子从精浆中分离出去，以限制非精子细胞对精子的损害是至关重要的。 随着我们对调节精子功能分子机制认识的增加，将会发展更多新的诊断检验方法。 例如，近期的数据强调细胞核中 DNA 致密性和完整性在确定人类精子功能活性方面的重要性。 新出现的证据建议将精子 DNA 完整性及染色质组织与生育力联合起来考虑。 (Sakkas et al., 1998。 Aitken amp。 Krausz, 2020。 Virro et al., 2020)。 我们在信号传导路径调节精子功能方面认识的进展，同样也将促进相关诊断性实验的发展，这在不育男性精子的检测中是有缺陷的。 为了更深入认识男性不育的生物学本质，已经开展了一组功能性试验，旨在评估人精子完成基本受孕过程的能力，如精子 卵子透明带结合试验，顶体反应试验以及与卵母细胞卵黄膜融合试验。 活性氧类物质 前言 中段带有多残留细胞质的异常精子会产生过多的活性氧类物质 (ROS)，并且细胞质内存在高活性的细胞质酶，如肌酸磷酸激酶。 (Rao et al., 1989。 Gomez et al., 1996。 Aitken et al., 2020)。 活性氧类物质是氧的代谢产物，包括超氧阴离子、过氧化氢、氢氧根、过氧化氢根和一氧化氮。 当过量存在时，这些活性氧类物质通过诱发细胞脂质、蛋白质和 DNA 的氧化损伤而造成病理性损害。 (Griveau amp。 Le Lannou, 1997。 Aitken et al., 2020。 Henkel et al., 2020)。 许多细胞具有酶 性抗氧化剂系统（超氧化物岐化酶、谷胱甘肽过氧化酶和过氧化氢酶）或非酶性抗氧化剂系统（尿酸、维生素 C、维生素 E）。 当这些防御机制受制时，精子功能将受到损伤。 (Agarwal et al., 2020)。 在人类射出的精液中，活性氧类物质是由精子 (Aitken amp。 Clarkson, 1987。 Alvarez et al., 1987。 Iwasaki amp。 Gagnon, 1992)和白细胞 (Aitken amp。 West, 1990)产生的。 精浆中有抗氧化物清除剂和酶，某些男性的这些物质可能不足 (Jones et al., 1979。 Smith et al., 1996)。 在制备辅助受孕的精子时去除精浆（见第 5章），有可能使精子更易受到氧化损害。 生成高浓度的 ROS 可能引起过氧化损害和精子功能丧失，也可能引起细胞核与线粒体基因组的 DNA 的损害 (Sawyer et al., 2020)。 常用精子存活定量测定来评估人类精子的质量。 这样含量测定的结果与精子脂质过氧化的状态密切相关。 (Gomez et al., 1998) 应用鲁米诺或 lucigenin 作为探针的化学发光过程，可以检测人精子产生 ROS 的量以及氧化还原剂的 活性。 精子悬液产生的活性氧类物质的测定 原理 此程序需要使用一个灵敏的照度计来检测存在化学发光探针，如鲁米诺或 lucigenin 时精子产生的少量的光。 这种方法是使用鲁米诺和辣根过氧化物酶的混合物，从而能够敏感地检测到过氧化氢的产物。 然而，也可以用其它探针（如 lucigenin）来检测洗涤后的人精子产生的活性氧类物质（ ROS）（ Aitken et al., 1992。 McKinney et al., 1996）。 由于人精子表面没有 FMLP 受体，由白细胞特异探针 formylmethionylleucylphenylalanine (FMLP)产生的化学发光信号对白细胞群是特异的，并且可以用含有已知数量的多形核白细胞悬液校正。 （见图 ） 注释 1：这些探针测定精子活力的精确性还是一个有争议的问题 (Aitken et al., 2020)，但是所得的数据反应精子功能。 (Zorn et al., 2020。 Said et al., 2020) 注释 2：白细胞产生活性氧类物质的能力至少是精子的 100倍。 因此含少量的白细胞就会对精子悬液产生的化学发光信号产生重要影响。 试剂 1．不含酚红的 Hank， s 平衡盐溶液 (HBSS)：见附录 4， A 小节。 2．不含酚红的 KrebsRinger 培养液（ KRM）：见附录 4， A 小节。 3． 25 mmol/l 鲁米诺： 29 mg 鲁米诺（ 5amino2,3dehy。