高二生物基因工程和细胞工程

高二生物基因工程和细胞工程内容摘要：

④ Northern杂交： 通过显影检查目的 DNA所在的位置。 Southern杂交和 Northern杂交过程示意图 Western杂交 （检测目的基因是否翻译成蛋白质） • 中文一般称为蛋白质印迹技术。 其基本原理是通过 特异性抗体 对凝胶电泳分离的细胞或生物组织 蛋白样品 进行检测。 • Western Blot与 Southern杂交或 Northern杂交方法类似，但 Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。 Western杂交过程 • ⑴ 经过 SDSPAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素膜）上； • ⑵以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应； • ⑶再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的目的蛋白。 • 根据检测结果，从而可得知被检细胞内目的蛋白表达与否、表达量及分子量等情况。 Western杂交结果图 常见载体容量 载体 质粒 λ 噬菌体 黏粒 细菌人工染色体（ BAC） 酵母人工染色体（ YAC） 容量 （ kb) 10 23 45 350 1000 （二）细胞工程 动物细胞融合与单克隆抗体 细胞融合（ cell fusion)， 又称体细胞杂交，是指两个或更多个相同或不同细胞通过膜融合，形成单个细胞的过程。 细胞融合的常用方法 一、灭活病毒法： 二、聚乙二醇（ PEG）法： 三、电融合法： 一、灭活病毒法 1. 两个原生质体或细胞在病毒黏结作用下彼此靠近； 2. 通过病毒与细胞膜的作用使两个细胞膜互相渗透，胞质互相渗透； 3. 两个细胞的细胞核互相融合，两个细胞融为一体； 4. 进入正常的细胞分裂途径，分裂成含有两种染色体的杂种细胞。 二、聚乙二醇（ PEG）法 • PEG分子式： HOH2C（ CH20CH2） nCH2OH，通常选用平均相对分子质量为 1000～ 4000、浓度在 30%～50%的 PEG进行动物细胞的诱导融合。 • PEG分子具有轻微的负极性，故可以与具有正极性基团的水、蛋白质和碳水化合物等形成 H键，从而在在质膜之间形成分子桥，其结果是使细胞质膜发生粘连进而促使质膜的融合 . PEG诱导融合的特点 ： 其优点是融合成本低，不需特殊设备；融合子异核率较高；融合过程不受物种限制。 其缺点是操作过程繁琐， PEG可能对细胞有毒害。 三、电融合法 细胞首先在交流电场中极化并沿电力线排列成串，形成细胞间的紧密接触；然后在高强度的直流电脉冲作用下，相互连接的细胞质膜被击穿而导致细胞融合。 电融合法的优点： 融合率高，重复性强，对细胞伤害小； 装置精巧，方法简单，可在显微镜下观察或录像观察融合过程； 免去 PEG诱导后的洗涤过程，诱导过程可控性强。 融合细胞的筛选 • 细胞融合后，会形成由未融合的亲本细胞、同核体以及异核体组成的细胞混合群体。 可根据不同细胞生理生化特性的差异，设计具体的筛选方案和选择体系，优先选择杂交细胞或只允许杂交细胞生长，以淘汰亲本细胞。 最常用方法是应用合适的选择培养基，使亲本细胞死亡，而仅让杂交细胞存活下来。 基于酶缺陷型细胞和药物抗性所建立的杂种筛选 基于营养缺陷型细胞所建立的杂种筛选 由温度敏感型细胞组成的杂种细胞的筛选 具有所需性状杂种细胞的筛选 常用的杂种细胞筛选方法 杂交瘤技术与单克隆抗体 抗体。