高二生物血红蛋白的提取和分离

高二生物血红蛋白的提取和分离内容摘要：

鉴定 ： （一）蛋白质提取和分离步骤 （二）操作过程 本课题可选用猪、牛、羊或其他脊椎 动物的血液来分离血红蛋白。 (1)红细胞的洗涤 : ① 洗涤目的 : 去除杂蛋白，以利于后续血红蛋白的 分离纯化，洗涤次数不可过少。 ② 洗涤操作： 采集血样。 低速短时间离心（速度越高和时间越长，会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀，达不到分离的效果） 吸取血浆：上层透明的黄色血浆。 盐水洗涤：用五倍体积的质量分数为％的氯化钠溶液洗涤。 低速离心 （低速短时间）重复 5步骤三次，直至上清液中已没有黄色，表明洗涤干净。 (2)血红蛋白的释放： 加蒸馏水到 原血液体积 ，再加40％体积的 甲苯 ，置于 磁力搅拌器 上充分搅拌 10分钟（ 加速细胞破裂 ） ,细胞破裂释放出血红蛋白。 (3)分离血红蛋白溶液： ① 过程： 将搅拌好混合液转移到离心管内，以 2020r/min的速度离心 10 min。 ②试管中溶液层次： 第 1层（最上层）：甲苯层（ 无色透明 ）；第 2层（中上层）：脂溶性物质沉淀层（ 白色薄层固体 ）；第 3层（中下层）：血红蛋白的水溶液层（ 红色透明液体 ）；第4层（最下层）：杂质沉淀层（ 暗红色 ）。 ③分离： 用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的 红色透明液体。 甲苯层 （ 无色透明 ） 白色薄层固体 红色透明液体 杂质沉淀层 （ 暗红色 ） 试管中溶液层次 (4)透 析： ① 过程： 取 1ml的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有 300ml的物质的量浓度为 20mmol/l的磷酸缓冲液 中（ pH为 ），透析 12小时。 ②透析目的： 除去样品中分子量较小的杂质。 透析过程动画演示 : （ 1）凝胶色谱柱的制作： ① 取长 40厘米，内径 ， 两端需用砂纸磨平。 ②底塞的制作： 打孔 → 挖出凹穴 → 安装移液管头部 → 覆盖尼龙网，再用 100目尼龙纱包好，插到玻璃管的 一 端。 注意事项 ： 底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。 ③顶塞的制作： 打孔 → 安装玻璃管。 ④组装： 将上述三者按相应位置组装成一个整体。 ⑤安装其他附属结构。 （ 2）凝胶色谱柱的装填 ① 凝胶的选择： A、材料： 交联葡聚糖凝胶（ G75）。 B、代表意义： “ G” 表示凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围。 75表示凝胶的得水值，即每克凝胶膨胀时吸水。 ② 凝胶的前处理： 配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后，配成凝。