农学]生物技术大实验实验手册试行

农学]生物技术大实验实验手册试行内容摘要：

leave it to solidify (2030min). It could be cooled at 4℃ for 15 min before loading samples. We often prepare such gels one day ahead and keep them covered with Saran Wrap at 4℃.18. Remove tapes, place tray in electrophoresis rig and pour enough TBE buffer (table ) in to cover the gel by at least cm. Remove bs only when ready to load samples.19. Run samples into gel according to the parameters in table until the bromophenol blue dye has migrated to just above the next set of wells. You may run gel at a higher rate, however resolution of the samples may suffer. Resolution can be improved by recirculating the buffer.20. Remove tray from rig and stain in 1μg/ml ethidium bromide (100μl of 10 mg/ml ethidium bromide in 1000 ml dH2O) for 20 min with gentle shaking. CAUTION: Ethidium bromide is extremely mutagenic—wear a lab gown and double gloves when handling and use extra precaution.21. Rinse gel in dH2O for 20 min, slide gel onto a UV transilluminator and photograph. For Fotodyne PCM10 camera with 2026 cm hood and Type 667 Polaroid film use an f8 or , 1sec exposure. For Fotodyne MP4 camera Type 665 Polaroid (negative) film use an f8 or , 2 min exposure.注意事项1．琼脂糖凝胶电泳时加样侧应位于负极端。 2．溴乙锭可引起基因突变，操作时要注意个人防护。 3．紫外光对人眼有害，观察时加盖玻璃罩，观察时间不宜太长。 实验五 PCR基因扩增及其影响因素分析实验目的了解聚合酶链式反应的原理。 掌握移液枪和PCR仪的基本操作技术。 实验原理PCR技术，即聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）是由美国PE Cetus公司的Kary Mullis在1983年（1993年获诺贝尔化学奖）建立的。 这项技术可在试管内的经数小时反应就将特定的DNA片段扩增数百万倍，这种迅速获取大量单一核酸片段的技术在分子生物学研究中具有举足轻重的意义，极大地推动了生命科学的研究进展。 它不仅是DNA分析最常用的技术，而且在DNA重组与表达、基因结构分析和功能检测中具有重要的应用价值。 PCR可以被认为是与发生在细胞内的DNA复制过程相似的技术，其结果都是以原来的DNA为模板产生新的互补DNA片段。 细胞中DNA的复制是一个非常复杂的过程。 参与复制的有多种因素。 PCR是在试管中进行的DNA复制反应，基本原理与细胞内DNA复制相似，但反应体系相对较简单。 PCR由变性退火延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应做准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板引物结合物在Taq酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。 重复循环变性退火延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。 每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。 材料Amplify core sequence of Bt gene from genomic DNA of transgenic maize plant and plasmid (CK) with the method of polymerase chain reaction.实验步骤22. On ice, in ml centrifuge tube, add:StockFor 20 μlFinal concentrationddH2OUp to 20 μl10 buffer μl1 25 mmol/L MgCl2 μl mmol/L mmol/L (each) dNTP μl150 μmol/L1 μmol/L (each) primers μl μmol/LTemplate DNA10 ng/μl pCUSBKHyg ? ng/μl Genomic DNA μl ? μl 5 ng50 ng5 U/μl Taq μl1 U23. Amplify from maize genomic DNA with following program:1 cycle of30 cycles of 1 cycle ofKeeping at94℃ for 5 min94℃ for 30 sec72℃ for 5 min4℃55℃ for 30 sec72℃ for 30 sec24. Amplify from plasmid with following program:1 cycle of30 cycles of 1 cycle ofKeeping at94℃ for 1 min94℃ for 10 sec72℃ for 5 min4℃55℃ for 10 sec72℃ for 30 secNOTE: Wear rubber or plastic gloves during the following steps. 25. In 500 ml flask, add g agarose and 200 ml TBE. Melt agarose in microwave oven, mixing several times during heating. Cool to about 60℃ keeping covered to avoid evaporation.26. Tape ends of gel tray, insert b, pour agarose in and allow to be solidified.27. Remove tape, place gel tray in electrophoresis tank, fill tank to about 1 mm higher than gel top face with TBE and remove b.28. Load Φ174 Hinc II in first well as molecular weight marker and amplified samples one by one.29. Run electrophoresis at 85 volt (5 volt/cm) until bromophenol blue has migrated to just above the next set of wells.30. Remove tray from tank, stain in μg/ml EB for 10 min with gentle shaking.31. Destain in 10 mmol/L MgCl2 for 5 min with gentle shaking.32. Rinse in H2O for 10 min with gentle shaking.33. Take picture with ultraviolet light in gel image system. 实验六 核酸印迹技术DIG标记探针的分子杂交实验目的掌握实验的核酸印迹技术基本原理，熟悉基本操作实验原理放射性核素因其灵敏度高而被人们利用在杂交筛选中，但它标记探针可利用时间短（放射性同位素有半衰期，），并且对人体有害，易污染环境，所以近年来逐步发展了非放射性杂交筛选。 按照标记方法的不同,主要有两类, 一种是预先已连在NTP 或dNTP上, 因此可象放射性核素标记的核苷酸一样用酶促聚合反应方法参入到核酸探针上, 如生物素, 地高辛等, 由于生物素等标记物是连接在碱基上, 而不是磷酸基团, 因此不能用多核苷酸激酶进行末端标记。 另一类是直接与核酸进行化学反应而连接在核酸上, 如生物素化学标记法的主要思路是: 将生物素与另一种化学性质较活泼的基团相连, 在特定的条件下是活泼基团活化而与核苷酸特定部位共价结合。 DIG（地高辛）、HRP（辣根过氧化物酶）及生物素等, 它们常通过显色，发光来显示杂交信号。 本实验中就是通过连接臂共价连接在dUTP C11上，如图13所示。 DIG标记的dUTP代替部分dTTP掺入待标探针中，经杂交后用与碱性磷酸酶Ap（alkaline phosphatase）连接的DIG抗体发生免疫反应，通过Ap使反应底物CSPD脱磷，脱磷后的产物不稳定，继续分解同图13 DIG标记的dUTP化学分子结构图14 Ap分解底物释放光子的反应过程图15 DIG标记探针的Southern blotting过程示意图材料，试剂和仪器 1 材料：模板 DNA转移的膜，待标DNA探针 2 试剂 1) DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II 试剂盒提供的试剂 浓缩的固体杂交液成分（DIG Easy Hyb granules），随机引物标记试剂(DIGHigh Prime)，10封闭液(Blocking solution)，DIG抗体AP(AntiDigoxigenin AP Conjugate)，反应底物CSPD(CSPD readytouse) 2）洗膜液： （1）2%SDS（2）%%SDS。 3）杂交及免疫反应所需附加的试剂 Maleic acid Buffer: Maleic acid（顺丁烯二酸） NaCl用固体NaOH。 Washing buffer: Maleic acid（顺丁烯二酸） NaCl,%(v/v)tween20,用固体NaOH。 Detection Buffer： TrisHCl、 NaCl及50mmol/L。 3仪器：恒温水浴震荡器（室温100℃），杂交袋，水浴锅，暗盒。 实验步骤 1) 取纯化好的待标DNA 1μg，体积为16μl，于100℃水浴中变性10min，取出后立即置于冰上5 min。 2) 在冰上加入4μl随机引物标记试剂,其中含有核苷酸混合物、随机引物、Klenow enzyme和反应缓冲液。 混匀后置37℃保温至少1hr，可长至20h以提高标记量。 3) 加2ul EDTA或65℃加热10min中止反应,置－20℃放置备用。 将处理好的NC膜用2SSC浸润5min后放到杂交袋中，加入预杂交液（用Maleic acid Buffer稀释10封闭液为1封闭液）50－100mL， 65℃预杂交30min6hr。 将预杂交过的膜放入杂交袋中，加入5mL的杂交液（用灭菌ddH2O溶解浓缩的固体杂交液成分）。 将标记好的探针沸水浴变性5－10min，冰上5min，加到杂交袋中，混匀，赶出气泡。 42℃摇动杂交过夜。 经过杂交的膜用洗膜液I（2SSC, %SDS）室温下振动洗膜5min，重复一次。 然后用洗膜液II（SSC, %SDS）6068℃洗两次，每次15min。 1) 用50mLWashing buffer短暂浸膜15min。 2) 将膜置1blocking solution 100mL中封闭30min。 3) 用1blocking solution按1：10000稀释DIG抗体AP至75mU/mL，将膜浸在10－20mL抗体溶液中30min。 4) 用100mL Washing buffer洗膜两次，每次15min。 5) 用20mL Detection Buffer平衡2～5min。 6．杂交信号检测 1）将杂交膜放入小塑料袋中，有DNA一面朝上，在上面加1mL反应底物CSPD。 赶走气泡，使反应液均匀分布，封口后1525℃平放5 min。 倒掉反应液，封口，37℃放置10 min增强光子释放。 2）用保鲜膜包好，暗室中压X光片。 曝光448hr。 注：光子的释放在最初的几个小时达到高峰，并能维持2448 hr。 注意事项DNA杂交信号没有或很弱可。