细胞培养技术入门

细胞培养技术入门内容摘要：

菌。 青霉素是 80 万单位 /瓶，用注射器加 4ml 灭菌双蒸水。 链霉素是 100 万单位 /瓶，加 5ml 灭菌双蒸水，即每毫升各为 20万单位。 ，使青链霉素的浓度最终为 100 单位 /ml。 1 单位＝ 1 微克。 五 .RPMI1640 的制备与消毒： 、调 PH 值、定容：先将培养基粉剂加入培养液体积 2/3 的双蒸水中 ,并用双蒸水冲洗包装袋 23 次 (冲洗液一并加入培养基中 ),充分搅拌至粉剂全部溶解 ,并按照包装说明添加一定的药品 .然后用注射器向培养基中加入配制好的青链霉素液各 , 使青链霉素的浓度最终各为 100 单位 /ml。 然后用一个当量的盐酸和 NaOH 调 PH到 左右。 最后定容至 1000ml，摇匀。 ：安装时先装好支架，按规定放好滤膜，用螺丝将不锈钢滤器和支架连接好。 然后卸下支架腿分别用布包好待消毒。 ：配制好的培养液通常用滤器过滤除菌。 通常用蔡式滤器在超净工作台内过滤。 ：将过滤好的培养液分装入小瓶内置于 4℃ 冰箱内待用。 100ml培养液中加入 1ml 谷氨酰胺溶液（ 4℃ 时两周 有效）。 六．血清的灭火： 细胞培养常用的是小牛血清，新买来的血清要在 56℃ 水浴中灭火 30 分钟后，再经过抽滤方可加入培养基中使用。 七 .HEPES 溶液： HEPES 的化学全称位羟乙基呱嗪乙硫磺酸（ N’ ahydroxythylpiperazineN’ ethanesulfanic acid ）。 对细胞无毒性作用。 它是一种氢离子缓冲剂，能较长时间控制恒定的 pH 范围。 使用终浓度为 1050mmol/L，一般培养液内含 20mmol/LHEPES 即可达到缓冲能力。 1mol/L HEPE 缓冲液配制方法如下： 准确称取 HEPTS ，加入新鲜三蒸水定容至 1L。 过滤除菌，分装后 4℃ 保存。 注意：因为现在市售 HEPES 为约 10g 包装的小瓶，所以可根据实际情况灵活配制，但是要保证培养液内 HEPES的终浓度仍然为 20m mol/L。 如：称取 克 HEPES 溶于 20ml 三蒸水中，过滤除菌后可完全（ 20ml）加入 1L 培养液中，或者每 100ml 培养液中加入 2ml 即可。 八 .谷氨酰胺： 合成培养基中都含有较大量的谷氨酰胺，其作用非常重要，细胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白质，谷氨酰胺缺乏要导致细胞生长不良甚至死亡。 在配制各种培养液中都应该补加一定量的谷氨酰胺。 由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定， 4℃ 下放置 1 周可分解 50％，故应单独配制，置于 20℃ 冰箱中保存，用前加入培养液。 加有谷氨酰胺的培养液在 4℃ 冰箱中储存 2 周以上时，应重新加入原来的谷氨酰胺。 一般培养液中谷氨酰胺的含量为 1～ 4mmol/L。 可以配制 200mmol/L 谷氨酰胺液贮存，用时加入培养液。 配制方法为，谷氨酰胺 溶于三蒸水加至 100ml 即配成 200mmol/L 的溶液，充分搅拌溶解后，过滤除菌，分装小瓶， 20℃保存，使用时可向 100ml 培养液中加入 1ml 谷氨酰胺溶液。 九 .肝素溶液的配制： 含有肝素的培养液可以使内皮细胞纯度提高，肝素加入全培养液中最终浓度为 50ug/ml。 因为现在市售的多为肝素钠，包装为约为 克 /瓶，配制时，可将其溶于 100ml 三蒸水中，定容，过夜，然后过滤除菌，分装小瓶，保存温度为 ℃。 使用时，向 100ml 培养液中加入 1ml（精确可加入 ）即可。 十 . Ⅰ 型胶原酶： ％ Ⅰ 型胶原酶溶液同胰蛋白 酶一样配制和消毒灭菌。 注意：因为 Ⅰ 型胶原酶分子颗粒比胰酶大，不容易过滤，因此可以用蔡式滤器过滤除菌。 分装入 10ml 小瓶 20℃ 保存。 十一 .明胶溶液： 因为明胶难于过滤，所以配制 ％明胶溶液必须用无菌的 PBS 配制。 所以制备过程中必须要注意无菌操作。 首。