09届高三生物组织培养技术

09届高三生物组织培养技术内容摘要：

4)上工作台后，用酒精棉球擦拭双手，特别是指甲处。 然后擦拭工作台面； • (5)先用酒精棉球擦拭接种工具，再将镊子和剪子从头至尾过火一遍，然后反复过火尖端处，对培养皿要过火烤干； • (6)接种时，接种员双手不能离开工作台，不能说话、走动和咳嗽等； • (7)接种完毕后要清理干净工作台，可用紫外灯灭菌 30min。 • 若连续接种，每 5天要大强度灭菌一次。 三、接种 • (1)将初步洗涤及切割的材料放人烧杯，带入超净台上，用消毒剂灭菌，再用无菌水冲洗，最后沥去水分，取出放置在灭过菌的 4层纱布上或滤纸上。 • (2)材料吸干后，一手拿镊子，一手拿剪子或解剖刀，对材料进行适当的切割。 如叶片切成 ；茎切成含有一个节的小段。 微茎尖要剥成只含 l— 2片幼叶的茎尖大小等。 在接种过程中要经常灼烧接种器械，防止交叉污染。 • (3)用灼烧消毒过的器械将切割好的外植体插植或放置到培养基上。 具体操作过程是：先解开包口纸，将试管几乎水平拿着，使试管囗靠近酒精灯火焰，并将管口在火焰上方转动，使管口里外灼烧数秒钟。 若用棉塞盖口，可先在管口外面灼烧，去掉棉塞，再烧管口里面。 然后用镊子夹取一块切好的外植体送入试管内，轻轻插入培养基。 若是叶片直接附在培养基上，以放 1— 3块为宜。 至于材料放置方法除茎尖、茎段要正放 (尖端向上 )外，其他尚无统一要求。 放置材料数量现在倾向少放，通过统计认为：对外植体每次接种以一支试管放一枚组块为宜，这样可以节约培养基和人力，一旦培养物污染可以抛弃，接完种后，将管口在火焰上再灼烧数秒钟。 并用棉塞，塞好后，包上包口纸，包囗纸里面也要过火。 第二节 培养和驯化 • 指把培养材料放在培养室 (有光照、温度条件 )里，使之生长，分裂和分化形成愈伤组织或进一步分化成再生植株的过程。 1．培养方法 • (1)固体培养法 即用琼脂固化培养基来培养植物材料的方法。 是现在最常用的方法。 虽然该方法设备简单，易行，但养分分布不均，生长速度不均衡，并常有褐化中毒现象发生。 • (2)液体培养法 即用不加固化剂的液体培养基培养植物材料的方法。 由于液体中氧气含量较少，所以通常需要通过搅动或振动培养液的方法以确保氧气的供给，采用往复式摇床或旋转式摇床进行培养，其速度一般为 50100r／ min，这种定期浸没的方法，既能使培养基均一，又能保证氧气的供给。 2．培养步骤 • (1)初代培养 初代培养旨在获得无菌材料和无性繁殖系。 即接种某种外植体后，最初的几代培养。 初代培养时，常用诱导或分化培养基，即培养基中含有较多的细胞分裂素和少量的生长素。 初代培养建立的无性繁殖系包括：茎梢、芽丛、胚状体和原球茎等。 根据初代培养时发育的方向可分为： 1)顶芽和腋芽的发育 • 采用外源的细胞分裂素，可促使具有顶芽或没有腋芽的休眠侧芽启动生长，从而形成 一个微型的多枝多芽的小灌木丛状的结构。 在几个月内可以将这种丛生苗的一个枝条转接继代，重复芽 —— 苗增殖的培养，并且迅速获得多数的嫩茎。 然后将一部分嫩茎转移到生根培养基上，就能得到可种植到土壤中去的完整的小植株。 一些木本植物和少数草本植物也可以通过这种方式来进行再生繁殖，如月季、茶花、菊花、香石竹等等。 这种繁殖方式也称作微型扦插，它不经过发生愈伤组织而再生，所以是最能使无性系后代保持原品种特性的一种繁殖方式。 • 适宜这种再生繁殖的植物，在采样时，只能采用顶芽、侧芽或带有芽的茎切段，其他如种子萌发后取枝条也可以。 • 茎尖培养可看作是这方面较为特殊的一种方式。 它采用极其幼嫩的顶芽的茎尖分生组织作为外植体进行接种。 在实际操作中，采用包括茎尖分生组织在内的一些组织来培养，这样便保证了操作方便以及容易成活。 • 用靠培养定芽得到的培养物一般是茎节较长，有直立向上的茎梢，扩繁时主要用切割茎段法，如香石竹、矮牵牛、菊花等。 但特殊情况下也会生出不定芽，形成芽丛。 2)不定芽的发育 • 在培养中由外植体产生不定芽，通常首先要经脱分化过程，形成愈伤组织的细胞。 然后，经再分化，即由这些分生组织形成器官原基，它在构成器官的纵轴上表现出单向的极性 (这与胚状体不同 )。 多数情况下它先形成芽，后形成根。 • 另一种方式是从器官中直接产生不定芽，有些植物具有从各个器官上长出不定芽的能力如矮牵牛、福禄考、悬钩子等。 当在试管培养的条件下，培养基中提供了营养，特别是提供了连续不断植物激素的供应，使植物形成不定芽的能力被大大地激发起来。 许多种类的外植体表面几乎全部为不定芽所覆盖。 在许多常规方法中不能无性繁殖的种类，在试管条件下却能较容易地产生不定芽而再生，如柏科，松科，银杏等一些植物。 许多单子叶植物储藏器官能强烈地发生不定芽，用臼合鳞片的切块就可大量形成不定鳞茎。 • 在不定芽培养时，也常用诱导或分化培养基。 用靠培养不定芽得到的培养物，一般采用芽丛进行繁殖，如非洲菊、草莓等。 3)体细胞胚状体的发生与发育 • 体细胞胚状体类似于合子胚但又有所不同，它也通过球形、心形、鱼雷形和子叶形的胚胎发育时期，最终发育成小苗。 但它是由体细胞发生的。 胚状体可以从愈伤组织表面产生，也可从外植体表面已分化的细胞中产生，或从悬浮培养的细胞中产生，也可从外植体表面已分化的细胞中产生，或从悬浮培养的细胞中产生。 (2)继代培养 • 在初代培养的基础上所获得的芽、苗、胚状体和原球茎等，数量都还不多，它们需要进一步增殖，使之越来越多，从而发挥快速繁殖的优势。 • 继代培养是继初代培养之后的连续数代的扩繁培养过程。 旨在繁殖出相当数量的无根苗，最后能达到边繁殖边生根的目的。 继代培养的后代是按几何级数增加的过程。 如果以 2株苗为基础，那么经 10代将生成 210株苗。 • 继代培养中扩繁的方法包括：切割茎段、分离芽丛、分离胚状体、分离原球茎等。 切割茎段常用于有伸长的茎梢、茎节较明显的培养物。 这种方法简便易行，能保持母种特性。 培养基常是 MS0基本培养基；分离芽丛适于由愈伤组织生出的芽丛。 培养基常是分化培养基。 若芽丛的芽较小，可先切成芽丛小块，放人 MS0培养基中，待到稍大时，再分离开来继续培养。 • 增殖使用的培养基对于一种植物来说每次几乎完全相同．由于培养物在接近最良好的环境条件，营养供应和激素调控下，排除了其他生物的竞争，所以能够按几何级数增殖；； • 在快速繁殖中初代培养只是一个必经的过程，而继代培养则是经常性不停的进行过程。 但在达到相当的数量之后，则应考虑使其中一部分转入生根阶段。 从某种意义上讲，增殖只是贮备母株，而生根才是增殖材料的分流，生产出成品。 培养过程中常出现的问题及解决方法 初代培养外植体的褐变 • 外植体褐变是指在接种后，其表面开始褐变，有时甚至会使整个培养基褐变的现象。 它的出现是由于植物组织中的多酚氧化酶被激活，而使细胞的代谢发生变化所致。 在褐变过程中，会产生醌类物质，它们多呈棕褐色，当扩散到培养基后，就会抑制其他酶的活性，从而影响所接种外植体的培养。 褐变的主要原因 • ① 植物品种 研究表明，在不同品种间的褐变现象是不同的。 由于多酚氧化酶活性上的差异，因此，有些花卉品种的外植体在接种后较容易褐变，而有些花卉品种的外植体在接种后不容易褐变。 因此，在培养过程中应该有所选择，对不同的品种分别进行处理。 • ②生理状态 由于外植体的生理状态不同，所以在接种后褐变程度也有所不同。 一般来说，处于幼龄期的植物材料褐变程度较浅，而从已经成年的植株采收的外植体，由于含醌类物质较多，因此褐变较为严重。 一般来说，幼嫩的组织在接种后褐变程度并不明显，而老熟的组织在接种后褐变程度较为严重。 • ③培养基成分 浓度过高的无机盐会使某些观赏植物的褐变程度增加，此外，细胞分裂素的水平过高也会刺激某些外植体的多酚氧化酶的活性，从而使褐变现象加深。 • ④培养条件不当 如果光照过强、温度过高、培养时间过长等，均可使多酚氧化酶的活性提高，从而加速被培养的外植体的褐变程度。 减轻褐变现象发生的方法 • ① 选择合适的外植体 一般来说，最好选择生长处于旺盛的外植体，这样可以使褐变现象明显减轻。 • ②合适的培养条件 无机盐成分、植物生长物质水平、适宜温度、及时继代培养均可以减轻材料的褐变现象。 • ③使用抗氧化剂 在培养基中，使用半胱氨酸、抗坏血酸、 PVP等抗氧化剂能够较为有效地避免或减轻很多外植体的褐变现象。 另外，使用 %%的活性炭对防止褐变也有较为明显的效果。 • ④连续转移 对容易褐变的材料可间隔 12~24h的培养后，再转移到新的培养基上，这样经过连续处理 7l0d后，褐变现象便会得到控制或大为减轻。 继代培养时材料的玻璃化 • 实践表明，当植物材料不断地进行离体繁殖时，有些培养物的嫩茎、叶片往往会呈半透明水渍状，这种现象通常称为玻璃化。 它的出现会使试管苗生长缓慢、繁殖系数有所下降。 玻璃化为试管苗的生理失调症。 • 因为出现玻璃化的嫩茎不宜诱导生根，因此，使繁殖系数大为降低。 在不同的种类、品种间，试管苗的玻璃化程度也有所差异。 当培养基上细胞分裂素水平较高时，也容易出现玻璃化现象。 在培养基中添加少量聚乙烯醇、脱落酸等物质，能够在一定程度上减轻玻璃化的现象发生。 • 呈现玻璃化的试管苗，其茎、叶表面无蜡质，体内的极性化合物水平较高，细胞持水力差，植株蒸腾作用强，无法进行正常移栽。 这种情况主要是由于培养容器中空气湿度过高，透气性较差造成的，其具体解决的方法为： • ①增加培养基中的溶质水平，以降低培养基的水势； • ②减少培养基中含氮化合物的用量； • ③增加光照； • ④增加容器通风，最好进行 CO2施肥，这对减轻试管苗玻璃化的现象有明显的作用； • ⑤降低培养温度，进行变温培养，有助于减轻试管苗玻璃化的现象发生； • ⑥降低培养基中细胞分裂素含量，可以考虑加入适量脱落酸。 3．生根培养 • 当材料增殖到一定数量后 ， 就要使部分培养物分流到生根培养阶段。 若不能及时将培养物转到生根培养基上去 ， 就会使久不转移的苗子发黄老化 ，或因过分拥挤而使无效苗增多造成抛弃浪费。 根培养是使无根苗生根的过程 ， 这个过程目的是使生出的不定根浓密而粗壮。 生根培养可采用 1／ 2或者 1/4MS培养基 ， 全部去掉细胞分裂素 ， 并加入适量的生长素 (NAA、 IBA等 )。 诱导生根方法： • ① 将新梢基部浸入 50或 100 106I IBA溶液中处理 4— 8h； ② 在含有生长素的培养基中培养 46d； ③ 直接移入含有生长素的生根培养基中。 上述三种方法均能诱导新梢生根 ， 但前二种方法对新生根的生长发育则更为有利。 而第三种对幼根的生长有抑制作用。 其原因是当根原始体形成后较高浓度生长素的继续存在 ， 则不利于幼根的生长发育。 不过这种方法比较可行。 • 另外也可采用下列方法就可生根：①延长在增殖培养基中的培养时间；②有意降低一些增殖倍率，减少细胞分裂素的用量 (即将增殖与生根合并为一步 )；③切割粗壮的嫩枝在营养钵中直接生根，此方法则没有生根阶段。 可以省去一次培养基制作，切割下的插穗可用生长素溶液浸蘸处理，但这种方法只适于一些容易生根的作物。 • 另外少数植物生根比较困难时，则需要在培养基中放置滤纸桥，使其略高于液面，靠滤纸的吸水性供应水和营养，从而诱发生根。 • 从胚状体发育成的小苗 ， 常常有原先已分化的根 ， 这种根可以不经。