精品]发酵工程技术实验指导书

精品]发酵工程技术实验指导书内容摘要：

9 个，编号标明 10 10 107各三套；按无菌操作将经高温消毒冷却到 50℃左右的培养基注入 9 个平皿，每皿约 15mL； 转动平皿， 使培养基均匀分布在皿底，待凝固。 检样的吸取：用三支 1 mL 无菌移液管分别吸取 10 106和 107的稀释菌悬液各 mL，对号接入与之对应的 3 个无菌平皿中，尽快用无菌玻璃涂棒将菌液在平板上涂布均匀，平放于试验台上 20min；待样液吸收后倒置平皿于 40℃恒温箱中培养 48 h。 菌落观察：取出已培养 48 h 培养平皿；选择菌落分布较好的平板，先对其菌落形态进行观察，初步找出典型的乳酸菌菌落。 乳酸菌的菌落很小，大约 13mm，圆形隆起，表面光滑或稍粗糙，呈乳白色、灰白色或暗黄色。 镜检：取干净载玻片一块，在载玻片中央加一滴生理盐水，无菌操作法取少量菌体涂片，经革兰氏染色后用油镜观察，菌体被染成蓝紫色的是乳酸菌；其中乳酸杆菌呈杆状，成单杆、双杆或长丝状；乳酸杆菌，呈球状，成对或短链或长链状。 34 （二）乳酸菌的鉴别 选取乳酸菌典型菌落转至脱脂乳试管中， 40℃培养 8~24h。 观察与测定：为了便于测定乳酸发酵情况，取脱脂乳试管中的溶液进行革兰氏染色，显微镜检查。 革兰氏阳性，无芽胞的球菌或杆菌可定为乳酸菌，记录测定结果。 （ 1）观察并记录各试管的凝乳时间 （2）酸度测定：用 NaOH 滴定法，测定发酵乳液的滴定酸度 滴定酸度：吸取 10ml 牛乳，置于 250ml 三角瓶中，加入 20ml 水，再加入 %的酚酞乙醇溶液，小心摇匀，用 N 氢 氧化钠标准溶液滴至微红色（见注），在 1 min 内不消失为止。 消耗 氢氧化钠标准溶液的毫升数乘以 10，即得酸度（ 176。 T ）。 注：滴定酸度终点判定标准颜色的制备方法如下。 取滴定酸度测定的同批和同样数量的样品如牛乳 10ml，置于 250 ml 三角烧瓶中，加人 20ml 蒸馏水，再加入 3 滴 %碱性品红溶液，摇匀后作为该样品滴定酸度终点判定的标准颜色。 其他产品酸度滴定的标准颜色的制备，可根据其标准滴定酸度测定的取样量和加水稀释量的总容积，参照本方法按比例增加或减少 %碱性品红滴数即可。 （3）计数：采用倾注平板法，测定菌落数量 六、实验结果 菌种培养观察 35 并记录结果 时间 观察并记录 105 106 107 48h 菌落观察 镜检形态 脱脂乳发酵观察与测定 时间 /h 凝乳状态 酸度测定 活菌计数 24 七、 革兰氏染色注意事项： 涂片不宜过厚，且 36 应将它涂均匀，如果太粘稠就用无菌水进行稀释，这 样更能观察细菌的形态。 染色过程中，染液要覆盖菌体，用水冲洗时应吸去玻片上的残水，以免染色液被稀释影响染色结果，且水流不宜过大，以免菌体被冲走。 染色成败关键是脱色的时间，时间过短，革兰氏阴性菌也会被染成革兰氏阳性菌，脱色过度，革兰氏阳性菌也会被染成革兰氏阴性菌。 另外，时间长短还与涂片薄厚、乙醇用量有关。 染色不宜过深，这样不利于观察细菌的形态 37 实验四 酸奶制作以及感官鉴评 一、实验目的 了解酸乳的制作方法 二、实验原理 酸乳是以牛奶等为原料，经乳酸菌发酵而成的一种具有较高营养价值和特殊风味的发酵乳制品。 由于乳酸菌的作用，牛奶中的乳糖被降解产生乳酸，随着 pH 的下降，达到牛奶中酪蛋白的等电点后，则牛奶的溶解度降低，蛋白质变性凝固，从而使牛奶成凝乳状态。 同时，通过发酵还可形成乙醛、丁二酮、丙酮和挥发性酸等，赋予酸奶特有的香味和风味。 三、实验材料及试剂 已分离乳酸菌、脱脂 38 乳粉、蔗糖等。 酸度测定所需试剂 0.5%的酚酞乙醇溶液：0.5g酚 39 酞溶于95%乙醇，定容至100ml 0.1 N 氧化钠标准溶液 0.005%碱性品红溶液：取 碱性品红加少量乙醇溶解，再加水定容至 100ml 四、仪器设备 恒温水浴锅、高压蒸汽灭菌锅、超净工作台、恒温培养箱、折光仪、试管、 300ml三角瓶、 250ml 三角瓶、 10ml 吸管、碱式滴定仪、保鲜膜、酒精灯、烧杯等 五、实验步骤 基料配制： 40 将脱脂乳粉、蔗糖和水以10：5：70的比例混合。 巴氏杀菌：通常在6 41 0～65℃下保持30min。 牛乳冷却：牛乳经巴氏杀菌后用水冷却，至 40～ 45℃ 时接种。 菌种扩大：分离到的乳酸菌用上述培养基料 50mL 进行扩大培养。 发酵：经培养好的乳酸菌液以5% 42 的接种量接入上述培养基料100mL中， 摇匀，以保鲜膜封口。 接种后置于 40℃ 恒温箱中培养至凝乳块出现（约 3～ 4 小时），然后转入 4℃ 冰箱中后熟（ 24 小时以上），使酸度适中，凝块均匀细腻，无乳清析出，色泽均匀，无气泡，获得较好的口感和特有风味。 酸奶感官检验及固形物含 43 量及酸度测定：测定结果应符合下列参数要求。 项 目 纯酸牛乳 色泽 呈均匀一致的乳白色或微黄色 组织状态 组织细腻、均匀，允许有少量浮清析出；果料酸牛乳有果块或果粒 滋味和气味 具有酸牛乳固有的滋味和气味 酸度（ 176。 T） 70110 固形物含量（ %） 折光计法测定固形物的方法： 样品处理：将试样充分混匀，用四层纱布挤出滤液，弃去最初几滴，收集滤液供测试用。 温度控制在 20℃。 样品测定： （ 1）测定前按说明书校正折光计。 （ 2）分开折光计两面棱镜，用脱脂棉蘸乙醚或乙醇擦净。 （ 3）用末端熔圆之玻璃棒蘸取处理后之样品 2～ 3 滴，滴于折光计棱镜面中央（注 44 意勿使玻璃棒触及镜面）。 （ 4）迅速闭合棱镜，静置约 1min，使样品均匀无气泡，并充满视野。 （ 5）对准光源，通过目镜观察接物镜。 调节指示规，使视野分成明暗两部分，再旋转微调螺旋，使 明暗界限 清晰，并使其 分界线 恰在接物镜的十字交叉点上。 读取目镜视野中的百分数或折光率，并记录棱镜温度。 （ 6）目镜读数即为可溶性固形物的百分含量。 注：同一样品两次测定值之差，不得超过 %。 六、实验报告 将发酵的酸奶评定结果记录于下表中。 项目 凝乳 情况 乳清 淅出 粘度 表面 气泡 表面 光泽 酸度 香味 异味 固形物 结果 结论 七、思考题 酸乳发酵过程中为什么会引起凝乳。 实验五 土壤中产醋酸菌种的分离筛选 一、实验目的 从特定的样品如土壤中筛选出高产适宜的菌株，加深对发酵工程上游技术中菌种选育的认识；学会常规选种和育种的方法，树立科学认真仔细的态度，培养科研协作精神。 45 二、实验原理： 分离土样中的大部分细菌的分离程序中无需进行富集，但对某些少数 细菌则要求特殊的富集或选择技术才能很好地被分离培养。 运用细菌的酶诱导性，在分离培养基中添加若干抗生素、复杂底物及生长因子的前体物质来激活细菌某一特殊 基因组，可以建立若干富集技术。 同样，富集可以促进抗性的产生并维持下来。 产醋酸菌种在含有一定量碳酸钙的牛肉膏蛋白胨固体培养基中培养后，形成混浊半透明状态。 根据菌体产生酸溶解出现透明圈大小以及滴定结果，判断产醋酸能力的大小。 三、实验材料及试剂 牛肉膏蛋白胨培养基 ： 牛肉膏 克，蛋白胨 克，氯化钠 克，琼脂 20 克，蒸馏水 1000mL， ～ 产醋酸菌分离培养基：牛肉膏蛋白胨培养基 灭菌 后，加入 5%无菌碳酸钙和 %无水乙醇。 0.1moL/LNaOH、 5%三氯化铁溶液（质量比）、碳酸钙 土样浸出汁制备：称取 5g 在 105～ 115℃下烘干的土壤样品，放入 50mL 干燥的锥形瓶中，加入 25mL。 用玻璃棒把土壤。