高中生物同步课件：53血红蛋白的提取和分离2人教版选修1

高中生物同步课件：53血红蛋白的提取和分离2人教版选修1内容摘要：

，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的 红色透明液体。 甲苯层（无色透明） 白色薄层固体 红色透明液体 杂质沉淀层（暗红色） 试管中溶液层次 (4)透 析： ① 过程： 取 1ml的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有 300ml的物质的量浓度为 20mmol/l的磷酸缓冲液中（ pH为 ），透析 12小时。 ②透析目的： 除去样品中分子量较小的杂质。 透析过程动画演示 : （ 1）凝胶色谱柱的制作： ① 取长 40厘米，内径 ， 两端需用砂纸磨平。 ②底塞的制作： 打孔 → 挖出凹穴 → 安装移液管头部 → 覆盖尼龙网，再用 100目尼龙纱包好，插到玻璃管的 一 端。 注意事项 ：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。 ③ 顶塞的制作： 打孔 → 安装玻璃管。 ④组装： 将上述三者按相应位置组装成一个整体。 ⑤安装其他附属结构。 （ 2）凝胶色谱柱的装填 ① 凝胶的选择： A、材料： 交联葡聚糖凝胶（ G75）。 B、代表意义 ： “ G” 表示凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围。 75表示凝胶的得水值，即每克凝胶膨胀时吸水。 ② 凝胶的前处理： 配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后，配成凝胶悬浮液。 ③ 凝胶色谱柱的装填方法： A、固定：将色谱柱装置固定在支架上。 B、装填：将凝胶悬浮液一次性缓慢倒入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。 注意： 凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。 装填凝胶柱时不得有气泡存在： 因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。 ④ 洗涤平衡： 装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在50cm高的操作压下，用 300ml的 20mmol/l的 磷酸缓冲液（ pH为 ） 充分洗涤平衡 12小时。 注意： 液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果。 不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。 （ 2）凝胶色谱柱的装填 50cm高 （ 3）样品加入与洗脱 ① 调节缓冲液面： 打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。 ②滴加透析样品： 吸管吸 1ml样品加到色谱柱的顶端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏凝胶面。 ③样品渗入凝胶床： 加样后打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。 ④洗脱： 小心加入 pH= 的 20mmol/l的磷酸缓冲液到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。 ⑤收集： 待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每。