乙型肝炎病毒表面抗原检测试剂盒(胶体金法)生产工艺研究及反应体系的建立研究资料

乙型肝炎病毒表面抗原检测试剂盒(胶体金法)生产工艺研究及反应体系的建立研究资料内容摘要：

4，结果均为阴性，故 2： 2 胶体金标记抗体，选择 ％比例加入 A104, 并以 15181。 g/ml 的抗体浓度进行标记结果符合要求。 2)检测 ，出现假阴。 建议加大检测线包被浓 度，提高灵敏度，去除假阴。 第 10 页 共 23 页 检测线包被浓度的确定 当 喷膜量为 ， 将 抗 HBs 单克隆抗体 A 稀释成不同浓度： 3mg/ml、 、 2mg/ml、 、 1mg/ml， 分别和 1mg/ml 的羊抗鼠 IgG 抗体同步喷涂硝酸纤维素膜。 用制备好的样品垫、免疫金结合垫以及其它辅料依次粘贴制成试剂条，测试内质控灵敏度参考品，在 30分钟内判定结果，检测结果如下： 表 5 检测线不同包被量对应的检测结果 包被浓度 检测样本 3mg/ml 1ng/ml 177。 177。 177。 177。 － 2ng/ml 177。 177。 177。 177。 － ＋ ＋ ＋ ＋ 177。 3ng/ml ＋ ＋ ＋ ＋ 177。 实验结果表明，检测线包被浓度过小时，弱阳性标本容易出现漏检；包被浓度过大，将使产品的灵敏度太高， 则容易出现假阳性条带。 1) 1mg/ml 包被浓度过低，导致灵敏度不足，检测 阴。 而 3mg/ml、 、 2mg/ml ，检测 1ng/ml 与 2ng/ml均出现假阳，结合成本考虑，选择 ； 2) ，故建议提高胶体金工作液的稀释倍数以降低灵敏度。 鼠 抗 HBsAg 单克隆抗体 B－ GOLD 工作液稀释倍数确定 用 金标结合物稀释液 作为金标抗 体 的保护液，将离心后的胶体金抗 体 结合物 100倍稀释测定 A524nm，体积 V1，分别按照 100A524nm,V1/ 100A524nm,V1/3 100A524nm,V1/40 计算稀释后的体积 V2。 将稀释后的抗 体 工作液按照每 1 毫升涂布 100cm2无纺布， 37℃干燥 4 小时，与样品垫、固相反应膜等其它辅料依次粘贴，裁切宽度为 1cm 检测内质控灵敏度参考品， 比较检测试条的效果。 第 11 页 共 23 页 表 6 鼠抗 HBsAg抗体 GOLD工作液稀释倍数确定 稀释倍数 检测样本 1/30 1/35 1/40 1ng/ml － － 177。 2ng/ml － 177。 177。 177。 ＋ ＋ 3ng/ml 177。 ＋ ＋ 备注： 100A524nm,V1/ 100A524nm,V1/3 100A524nm,V1/40分别用 1/ 1/3 1/40代替。 1)结果表明随着稀释倍数的增加，检测试条的灵敏度 降低 ；反之，灵敏度提高。 1/30计算金标抗体工作液稀释体积时，检测 ，而1/40 检测 1ng/ml 及 2ng/ml 标准品时则出现假阳； 2)1/35 计算金标抗体工作液稀释体积时虽然检测 2ng/ml 标准品时仍出现假阳，但检测 1ng/ml 及 、 3ng/ml 标准品时均符合要求，故选择 1/35 计算金标抗体胶体金工作液稀释体积。 3）建议减小裁切宽度以降 低灵敏度，消除假阳。 鼠抗 HBsAg 抗体 GOLD 反应膜组装 (裁切 )宽度 优化 将预先吸附有鼠抗 HBsAg 抗体 GOLD 结合物的无纺布膜干燥后，裁成不同的宽度，与固相载体硝酸纤维反应膜以及其它辅料依次粘贴后，裁切成试纸条，测试内质控灵敏度参考品，结果如下， 表 7 鼠抗 HBsAg抗体 GOLD反应膜组装 (裁切 )宽度选择 S4宽度 (mm) 检测浓度 5 6 7 8 9 1ng/ml － － － － － － － － － 2ng/ml － － － － － － － － 177。 177。 177。 177。 ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ 3ng/ml 177。 ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ 从上述结果可以看出，当宽度为 5mm，检测 ，宽度小于 6mm 时，检测 ；宽度为 9mm 时，检测 2ng/ml 样本与时出现假阳，而 、 、 裁切宽度检测阴性及阳性标准品时均符合要求，故选择金标抗体无纺布裁切宽度为 177。 1mm。 对照线 包被浓度的确定 第 12 页 共 23 页 确定包被体积后 ()，将稀释成不同 羊抗鼠 IgG 抗体 浓度： 2mg/ml、 1mg/ml、 ， 进行硝酸纤维素膜喷涂，重复做三批。 用制备好的样品垫、免疫金结合垫以及其它辅料依次粘贴制成试剂条， 通过检测 1 份内质控强阳性参考品、 1 份内质控阴性参考品， 在 30 分钟内判定结果， 比较 对照线的显色情况，结果如下表， 表 8 对照线显色情况 浓度及 S1批次 检测样本 2mg/ml lot1 lot2 lot3 lot1 lot2 lot3 lot1 lot2 lot3 lot1 lot2 lot3 P1 +++ +++ +++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ + + + N3 +++ +++ +++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ + + + 试验结果表明，对照线抗体的浓度小于 1mg/ml 时，对照线显色不是很明显，当达到 1mg/ml 以上时，显色情况就比较好，由于浓度选得太高，不仅增加成本，而且存在扩散的可能性，造成一定的假阳性。 因此，选择 1mg/ml 为对照线的包被浓度。 鼠抗 HBsAg 抗体 GOLD 结合物反应膜 干燥条件选择 将 鼠抗 HBsAg 抗体 GOLD 结合物工作液稀释后， 以每毫升 100cm2的面积均匀涂布在无纺布上，进行干燥条件的比较试验。 根据以往经验，胶体金标记蛋白在 20℃ 冷冻干燥并不稳定，因此我们选择了 37℃ 、室温 两 种条件进行干燥试验， 测试内质控灵敏度参考品， 30分钟判断结果。 表 9 鼠抗 HBsAg抗体 GOLD结合物反应膜干燥比较 条件及时间 检测样本 37℃ 室温 2（ h） 4（ h） 6（ h） 5（ h） 10（ h） 15（ h） 1ng/ml － － － － － － 2ng/ml 177。 － － 177。 － － ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ 3ng/ml ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ 通过上述的试验结果，室温、 37℃ 干燥过程中，涂布 抗 HBsGOLD 结合物稀释液的无纺布反应膜的颜色从红色变为略有发蓝。 我们通过对 室温、 37℃的产生的结果对比，即当 室温 5 小时时， 37℃干燥 2h 时，无纺布干燥不彻底，胶体金 抗体爬升速度较慢，增加了结果判定时间，同时会出现假 第 13 页 共 23 页 阳性。 室温 超过 10小时、 37℃超过 4小时时，检测结果符合要求，结果判断直观。 在这里我们通过控制室温和相对湿度，选择室温过夜晾干 (温度为 18～ 26℃ ，相对湿度小于45%) 包被硝酸纤维素膜的干燥选择 设定不同的干燥条件：室温 (6小时、 12小时、 16小时、 18 小时 )、 37℃干燥不同时间 (4 小时、 8小时、 12小时、 16小时 )，湿度均低于 45%。 封闭后再次经 37℃干燥 4小时后，与制备好的样品垫、免疫金结合垫以及其它辅料依次粘贴制成试剂条，检测内质控参考品，在 30 分钟内判定结果。 表 10 包被膜干燥选择 条件及时间 检测样本 室温 37℃ 干燥 6（ h） 12（ h） 16（ h） 18（ h） 4（ h） 8（ h） 12（ h） 16（ h） 1ng/ml － － － － － － － － 2ng/ml 177。 － － － 177。 － － － ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ 3ng/ml ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ 从上述结果可以看出，当湿度低于 45%时，室温 6小时、 37℃ 干燥 4小时 时，测试2ng/ml 参考品时，因为硝酸纤维素膜没有彻底干燥，样品的爬升速度较慢，而且膜面褪白不是很好； 室温 12 时、 37℃ 干燥 8小时 时，检测结果均符合标准要求，样本爬升的速度正常，膜面干净，结构直观、容易判断；室温 18 小时、 37℃ 干燥 16 小时 的检测结果一致，色度 没有明显的差别。 因此，包被硝酸纤维素膜可以选择室温或 37℃过夜干燥。 封闭时间的选择 设定不同的封闭条件：室温 (1小时、 2小时、 4 时、 6小时 )、 37℃ (1小时、 2小时、4 小时、 6 时 )，封闭后再次经 37℃干燥 4 小时后，与制备好的样品垫、免疫金结合垫以及其它辅料依次粘贴。