重组dna技术1

重组dna技术1内容摘要：

质粒载体 的一般结构 DNA克隆常用载体  基因克隆获得大量目的基因后 ， 就要使其在合适的宿主细胞 中表达 ， 产生需要的基因表达产物或使宿主生物具备所需的性状 ， 同时目的基因还能在宿主细胞中稳定遗传。 这一过程就是 遗传转化。  若需要让克隆的基因表达和产生大量编码蛋白 ， 可对转化的大肠杆菌进行培养使目的基因大量表达和积累。 对表达产物分离纯化便可获得想要的产品。  通过 DNA体外重组技术构建的重组质粒还可以直接用以转化蓝藻等原核生物或其他一些原生生物。 转化受体细胞和转化子的筛选 宿主菌或受体细胞  大肠杆菌  酵母  昆虫细胞  哺乳动物细胞  感受态细胞（ petent cell） 受体细胞和重组基因的导入 （ 转化或转染 ）  将目的基因克隆到 大肠杆菌细胞 中的操作步骤： 1． 获得目的基因和质粒载体； 2． 形成重组质粒； 3． 制备感受态细胞 ， 用重组质粒转化大肠杆菌细胞； 4． 培养大肠杆菌 ， 让重组质粒及外源目的基因形成大量拷贝； 5． 筛选含重组质粒的大肠杆菌细胞 ， 进行检查或鉴定。 pUC118质粒的 多克隆位点整合在 lacZ基因中 ， 该位点如果没有插入外源目的基因 ， lacZ基因便可表达出 半乳糖苷酶 ， 如果平板培养基中含有 IPTG（ 乳糖操纵子 的 诱 导物 ） 和 Xgal， Xgal（ 半乳糖苷酶的底物 ） 便会被 半乳糖苷酶水解成兰色 ， 大肠杆菌形成 蓝色克隆。 在多克隆位点插入外源目的基因，破坏了 lacZ基因的结构，大肠杆菌形成 白色的克隆 利用 lacZ基因的插入失活 筛选重组质粒 筛选克隆 pUC18载体还携带了 抗生素 （ antibiotic） 基因 ， 可 筛选重组质粒。  一般克隆基因的检查和鉴定方法  琼脂糖凝胶电泳分离鉴定大小不等的酶解片段： 磷酸基团带负电荷 酶解片段 向阳极移动 电场驱动力和凝胶阻力 ——不同迁移率 分子量标准参照物  酶切和电泳方法 Restriction mapping 酶切 克隆基因的检查和鉴定方法  32P标记的 DNA分子探针  杂交  放射自显影法  DNA杂交直接鉴定  植物遗传转化常用的方法  载体法转化 —— 农杆菌介导法 （ Ti质粒 ）  基因的直接转移 （ 1） 高压电脉冲电激穿孔 （ 2） 基因枪法 （ 3） 微注射法  构建缺失 chlL基因的蓝细菌突变株 （ 直接转化重组质粒 ）  纪念发明者 Edward Southern （ 1） 提取总 DNA （ 2） 酶解 （ 3） 电泳 （ 4。