PCR原理及其操作

PCR原理及其操作内容摘要：

PCR原理及其操作 反应流程试管中进行的 依据 机理； 体外 性和复性 的性质； 通过人为控制体外合成系统的温度 ，使 双链 单链 物退火 ， 物沿着单链模板延伸为双链 4种 200 引物 各 10 100模板 24 55温使双链 94 ， 30s）。 温下，引物与模板 55 ， 30s）。 温延伸。 70 72 ， 30 60s） 3 4 522557294时间（ 度（ ）低温退火2高温变性1适温延伸3重复 13步2530轮目的 00万倍以上度的改变控制。 变性 ） 、 引物与模板结合 （ 退火 ） 、 延伸 ） 三个步骤构成 此循环反复进行 ， 可使目的 理论扩增率： 2 ， 25 30循环 ， 目标 09倍。 实际扩增率： ( )n， 平均约为 75%。 由于引物和底物的消耗 ， 酶活力的下降等因素 ， 扩增产物的增加 ， 逐渐由指数形式变为线性形式 ， 所以实际上进行 30个循环后 ， 扩增倍数一般可达 106 107。 以上 “ 变性 、 退火 、 延伸 ” 三部曲为 1. 引物 （ 2. 酶 （ NA 3. 4. 模板 （ 5. （ 物的特异性取决于引物与模板论上，只要知道任何一段模板 能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，用物设计的原则 引物长度： 15用为 20引物扩增跨度： 以 200定条件下可扩增长至 10引物碱基： G+0宜， G+C 过多易出现非特异条带。 免 5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列；避免引物内部出现二级结构： 避免两条引物间互补，特别是 3端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带；引物 3端的碱基应严格要求配对： 特别是最末及倒数第二个碱基，以避免因末端碱基不配对而导致 引物中有或能加上合适的酶切位点 ，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处；引物的特异性： 引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性；引物量 ： 每 条引物的浓度 最低引物量产生所需要的结果为好 引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会2 合酶供应： 天然酶： 从栖热水生杆菌中提纯 基因工程酶： 大肠菌合成一个典型的 总反应体积为 100µ浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。 保存不当易变性失活 使用时应配成高浓度后 ，以 1M M 小量分装 ， 冰冻保存。 多次冻融会使 在 0 200，尤其是注意 4种 等摩尔配制 ） ， 如其中任何一种浓度不同于其它几种时 （ 偏高或偏低 ） ， 就会引起错配。 浓度过低又会降低 与 合 ， 使游离的 基因 板核酸的量与纯化程度，是 统 采用 来消化处理标本； 溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白， 能与蛋白质结合而沉淀； 蛋白酶 K 能水解消化蛋白质，特别是与 再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸提取的核酸即可作为模板用于 床检测标本 ：可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于 采用异硫氰酸胍或蛋白酶 防止度 在一般的 种 00µ时， 2.0 为宜 ; 度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增， 浓度过低会降低反应产物减少。 反应流程1. 温度与时间的设置2. 循环次数1、温度与时间的设置 设置变性 延伸三个温度点 标准反应中采用 三温度点法 ，双链0 95 变性，再迅速冷却至 40 60 退火，然后快速升温至70 75 延伸， 对于较短靶基因（长度 100 300采用 二温度点法 ， 将退火与延伸温度合二为一，一般采用 94 变性，65 左右退火与延伸。 变性温度与时间： 一般 93 94 ， 1若低于 93 则需延长时间 但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。 退火 (复性 )温度与时间： 退火温度是影响 退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基因序列的长度 对于 20个核苷酸， G+0%的引物， 55 作为选择最适退火温度的起点较为理想 链温度） 4(G+C)+2(A+T) 复性温度 = 5 10 ） 在 择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高 复性时间一般为 30 60s，足以使引物与模板之间完全结合引物的复性温度通过以下公式帮助选择合适的温度： 延伸温度与时间 ： 延伸温度：一般选择在 70 75 之间 常用温度为 72 过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。 延伸反应时间：根据待扩增片段长度而定 1伸时间 1够） 3 4 4扩增 105延伸时间过长会导致非特异性扩增 对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些2、循环次数 循环次数 决定 循环次数 主要取决于模板 循环次数： 选在 30 40次之间 循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。