Western blot 实验介绍及流程

Western blot 实验介绍及流程内容摘要：

Western blot 实验介绍及流程 仪 器 培 训验介绍及流程转装置 目的与要求掌握垂直电泳、电转的基本原理与操作步骤 培训内容熟悉 考核题目 电泳槽玻璃板、梳子、加样校准架等 电转移槽切胶板、黑白夹板、海绵垫等 电泳仪转装置用途： 用于生物学实验中对特定目的蛋白质的分离，定性及定量的检测分析，是 白免疫印迹）实验中非常重要的部分。 即组织细胞中的目的蛋白 ） 能特异性结合的原理 ， 通过化学反应使标记于结合后的特异性抗体上的显示剂 （ 如酶 、 金属离子 、 同位素 ） 显示一定的颜色或发光来对组织细胞内目的蛋白定性及半定量的研究。 验原理抗原一抗生物素标记的二抗 测蛋白表达实验流程提取总蛋白 蛋白浓度测定 967年由 1969年由 胶电泳，是在 二烷基磺酸钠，含有大量带负电荷的 级结构，在含有强还原剂的溶液中可与蛋白质形成 电泳样品加入样品缓冲液后 ,要在沸水中煮 3由于结合大量带负电荷的 比 蛋白质穿上带负电的 “ 外衣 ” ， 蛋白质本身带有的电荷则被掩盖了，从而起到消除各蛋白质分子之间自身的电荷差异的作用，蛋白质在移率主要取决于其分子量的大小。 A is to on 验流程1）配制分离胶注意：边配边平摇烧杯混匀，配好胶后迅速灌胶（ 2）灌分离胶灌胶之上轻轻加一层水或正丁醇液（ 3）配制浓缩胶注意：边配边平摇烧杯混匀，配好胶后迅速用滴管灌胶（ 4）灌浓缩胶倒掉分离胶上的水或正丁醇之后，倒置吸净残留溶液，灌注浓缩胶，将梳子插好 ,胶凝固好后有胶条的国产槽需要去掉胶条（浓缩胶与分离胶一般比例为 1： 3）（ 5）加 6）上样蛋白质含量要适量，上样总体积要适量（ 7）电泳50据分子量的大小确定电压和时间，一般溴酚蓝离胶下 上槽接负极，下槽接正极 2 to of a 验流程（ 1）剥胶用切胶板切去浓缩胶和多余的分离胶（ 2）准备滤纸和硝酸纤维素膜切滤纸和膜时一定要戴手套，大小与胶一致（ 3）浸泡滤纸、膜和海绵垫用转移液（含甲醇）浸泡，开门通风（ 4）制备“三明治”制备每一层时注意赶气泡（ 5）电转75V， 冰浴中进行， 黑板对黑极（），白板对白极（）电转操作步骤4 An is of is to of a of 验流程一抗孵育 ：必须选择可以抗抗原种属的一抗。 如做大鼠目的蛋白的检测，则我们选择的一抗可以是来自兔、人、小鼠的 抗大鼠 的抗体。 一抗浓度及孵育时间、温度很重要。 3 is a as to on 5 of on is a c of is or is to a to 验流程二抗孵育 ：二抗的选择根据一抗的种属来源，如：一抗是兔抗大鼠目的蛋白的抗体，则二抗应选择山羊或其他来源抗兔的抗体，而且二抗要标记有同位素或酶。 验流程6 it is on of to , a in of a 用仪器自动检测或在暗室内用验结果与分析 pr ot e l e v e c - f i n l iv e r s*00 . 511 . 522 . 50 14 28 56 e ( m g / m3)较目的蛋白与内参照蛋白的灰度值，可得到蛋白表达半定量分析结果考核题目1. 转装置的主要用途是什么。 2. 转装置主要由哪几部分构成。 3. . 意事项有哪些。 5. 细列出“三明治”的先后顺序 )。 注意事项有哪些。 6.。