药学实用仪器分析－荧光光谱分析法

药学实用仪器分析－荧光光谱分析法内容摘要：

药学实用仪器分析－荧光光谱分析法 荧光分析法用荧光来进行定性定量的分析法荧光分析法光照 分子基态 =激发态辐射跃迁 荧光若光源是：可见一紫外光源分子荧光分析法 由荧光波长可确定物质分子具有结构由荧光强度可测定物质含量原子特征光谱作光源原于荧光分析x 射线作光源x 射线荧光分析荧光分析法与可见紫外、红外比较：均属于分子光谱荧光 可见紫外、红外本质 发射光谱 吸收光谱灵敏度 100 100 选择性 高 一般但仪器价格昂贵第二节 基本原理一、分子荧光的发生过程（1）荧光和磷光荧光：由第一激发态单线态的最低振动能级回到基态任一振动能级就发射的光谱。 1、三线态：总自旋 S=1，由自旋，由多重性 M=2S+1=3 这样的分子受激后，产生能级分裂，这受激态为三线态。 单线态：总自旋 S=0，两个电子自旋相反， M=2S+1=1解释：大多数分子偶数电子，基态时，这些电子存在于各个原子轨道，成对自旋，方向相反，电子净自旋等于 0（S=0） ，因此是抗磁性的其能级不受外界磁伤影响而分裂。 这种电子能态为单线态，多重性 M=2S+1=1。 当基态分子的一个成对电子吸收光能而被激发的过程中，自旋方向不变，此时的激发态为激单线态。 若一个电子在激了态上自旋方向有改变，即自旋方向相同，则分子中电子的净自旋等于 1（S=1） ，这样的分子在磁场中受影响而分裂，M=2S+1=3，这种受激态为三线态。 E： 跃迁 跃迁单线态 单线态>单线态 三线态（自旋方向改变）跃过几率：看作 1） 10 学禁阻、几率小）1、荧光与磷光的产生：激发态基态 共四五条途径（若包括磷光产生）振动驰豫：（非辐射跃迁）从电子激发态的某一振动能级到达同一电子激发态的最低振动能级的过程为。 发生在同一个激发态的电子能级上。 14-1（b） 此过程反 10荧光发射：电子由第一激发态单线态的最低振动能级跃迁到基态的任一振动能级而了射的光量于为荧光。 （因可停在基态任振动能级上，得到的荧光谱线是几个非常靠近的峰值，进一步振动驰豫，很快回到 V=0）若发射荧光几率高，发射过程快 10光没长比激发波长要长，是因为返回基态是由第一激发态单重态最低振动能级，而在被激的电子由激发态单线较高振动能级最低振一时，已损失一部分能量（振动驰豫以热形式损失掉一部分）。 14-1（d）内部能量转换：（非辐射跃迁）受激分子将能量转变为非量子化的热能而加到电子基态。 第二电子激发态单线态第一电子激发态单线态基态单线态。 E0 E 小 14 2能级量好修正一下）第一电子激态 2的低振动能及相重迭，内部转换易发生。 10 部 ：内部能量转换后，分子通过一系列振动驰豫回到基态最低振动能吸。 注意：尽管使分子激发的波长有长有短，但发射荧光的波长是一样的。 （同一物质而言） ，且荧光波长比激发波长长。 三线态上两个激发态也会发生内部能理转换。 体系间跨越：激发态单线态激发态三线态 4-1（e）受激分子的电子在激发态发生自旋反转而改变多重性的过程与内部能量转换一样，当激发态的单线态 光量子减弱甚至会荧光熄灭。 例：含重原子（I，分子 自旋与轨道运动相互作用易发生体系间跃迁，使荧光减弱甚至熄灭。 溶液中有 O 2顺磁性物质总之，处于激发态的分子可通过四个途径回到基态，具体有无荧光发生，要看后三种途径哪种速度快几率大。 2、荧光量子效率： 激 发 光 的 量 子 数发 射 荧 光 的 量 子 数 一般 1光与磷光比较： 光成因 激发单线态基态单线态 激光三线态基态单线态E 荧 光激 磷荧激 照射后发射时间 10 10 共振荧光：当 荧 = 激 时的荧光为共振荧光。 迟带荧光：处于激发三线态的某些分子还可以通过又一次体系间跨越回到激发单线态，继而再发射荧光回到基态。 在室温下，磷光一般不易呈现，若安测磷光应在低温下，仪器应有低温设施。 二、激发光谱与荧光光谱：激发光源 单色器 样品池 透 过 光 检测器 发射 记录荧光发射各个方向都可测，为了防止透过示干扰，在其垂直的方向测荧光。 1、激发光谱：（与吸收光谱类似）固定发射光波长 发 （即第二个单色固定） ，依次改变激发波长 激 测荧光强度 F，以 作得荧光物质的激发光谱。 14线 光光谱：固定激发光波长 激 （即第一个单色器固色） ，依次改变发射波长 发 （即第二个单色器改变）测 F、以 作图得荧光光谱。 14践 4）荧光光谱上荧光强度最强的波长就是荧光发射波长。 即电子回到基态时以发射这个能量的几率最大。 激发光谱上荧光强度最强时的波长作激发光源可得到强度最大的荧光。 实验测得荧光物质的激发光谱与紫外吸收光谱形状相似。 是由于荧光物质吸收于这种波长的紫外光，才发射出荧光。 吸收愈强，发射的荧光也愈强。 区别在于吸收光谱测 A，而激发光谱测 F。 ，而有书则认为二者光谱一致，只不过以 F 代替了 A 即激发光谱是表观吸收光谱，经校正后可以一致。 说明： 若荧光物质的激光谱有两个或两个以峰时，不管使作哪个波长激发光源的波长，其荧光光谱的形状和峰高是相同的。 荧光光谱与激发光谱互为镜象。 14葸 图 14应看懂 图 14懂则本章基本内容已掌握。 激发光谱： E 荧光光谱 E 态 V=0第一激发态 V=0 递 递 C o:1 激发态 V=0基态 V=0 递 递 激发态 V=0基态态 V=0第一激发态 V=1 增 减 V=0 V=1 增 减态 V=0第一激发态 V=2 V=2 V=24高分辨仪器打击，所以可看出一高的峰。 由此图可看出 像关系。 A 峰由图 141 解释：由 2（精细结构）思考：若分别选 01，02 等做激发波长，能否得到类似的荧光光谱。 答：可以。 峰形、峰位相同，只不过 F 不同。 原因发射荧光均由第一激发态的最低振动能级基态各。 二、分子结构与荧光：1、两个必备条件： 分子一定要能吸收紫外，可光见光及具有吸光结构。 结构中有 *，n *，而 *引起是弱吸收，不足以发射荧光。 故实际上发射发射荧光分妇应有 *k 带，尤其是共轭强吸收时，荧光产生。 有较高的荧光量子效率。 2、结构与荧光：（1）具有 共轭双键和分子有利于发射荧光。 *， 大， ； *， 小， 小 电子共轭度增大 ， 荧。 例： 激 205 268 356 荧 278 321 404 ）平面刚性高的刚性结构分子荧分子荧光强例（3）空间位阻：其实质仍为刚性共面问题。 1 1酸盐= =)取代基影响：斥电子基团引入， 9（，等）吸电子基团引入， （，）减弱轭体系。 影响不大：H，+，响荧光的外界因素：1、温度：低温，。 （T分子运动加快，磁撞几率无辐射跃迁）例：某荧光物质乙醇液：O时以 10， F3%，降至，1原因：T，分子动能，非辐射失活。 2、溶剂：溶剂介电常数，极性 n *,E, * E, 溶剂含量原子或溶液、溶解氧（,） ，体系间跨越。 使，甚至熄灭。 溶剂粘度 ，F 3、影响：无荧光 兰色荧光 无荧光3、荧光熄灭剂的影响：54、激光光的影响：光闸不能常开，与可见紫外不能常开不太相同，可见紫外是防止光敏元件损坏而此处主要防止样品分解。 65、荧光物质浓度要稀，C时，偏离线性。 76、散时光影响：子和物质发生弹性磁撞时，不发生能量交换，仅光子方向改变，这种散解光为 波长与 射光相同。 拉漫光：光子和物质发生非弹性磁撞，光子改变方向同时，与物质有能量交换，散射光波长有所改变，这种光为。 两种散射的波长位置与荧光波长非常接近，常影响荧光纯度。 由图，当有 350发时，400的 被荧光掩盖而影响荧光纯度，有时还会使最大发射荧光波长产生偏移。 而以 320发时，两散射光均不干扰。 故：在测定时，安准确选择激发波长，即要产生最大荧光强度，又有能让荧光波长产生偏移。 宁可牺牲一些荧光强度也要保证荧光纯度。 如何选择 激 一 荧 ： 激 选 选 激 与 发 要有一定距离，避免溶剂散射光干涉。 第三节 荧光定量分析一、荧光强度与浓度关系：荧光强度 F 与溶液吸收光能和程度以及溶液中荧光物质的量子效率有关。 荧光强度 F 与被测物质吸收光的强度成正比。 受激后，可在各个方向发射荧光在透过光的方向不易测定 F。 F=K， （I 0 律： =10=K ， K ， e*级数泰勒展开： !31!2*=K ， -（1+）当浓度很小时，小，当 ，级数中第二项以后可以忽略。 F=K ， = 条件：C 小，使 生偏离。 二、荧光分析灵敏度：对于荧光法 F 检测微弱信号。 而对于分光光度法的吸收光谱， 小时，I/I 01 A0 无吸收若 C 不变，改变 射光 无用0收光谱受一定限制，灵敏度小于荧光光谱。 二、分析方法：1、 工作曲线法：（与可见紫外对照讲） 吸收曲线（可紫）找 紫）找 激 对照可见紫外： A 0 测 F， 可紫外。