药学实用仪器分析－高效液相色谱

药学实用仪器分析－高效液相色谱内容摘要：

药学实用仪器分析－高效液相色谱 1高效液相色谱第一节 概述优 缺经典 用范围广 效率低效、高速，高灵敏度、自动化 300 多万化合物中仅 20%能用 经典液相色谱 三个突破1、高效填料：5m 10m 高效 （经典 2、高压泵输液： 高压3、高灵敏度的检测器： 仪器化点：1、适用范围广 2、高效 3、高速 4、高灵敏度（主要用 5×10、流动相选择范围宽 6、柱可以反复使用（可用 1）7、流动组分易收集 8、安全第二节 基本原理一、范氏方程：1、柱内展宽：H=A+B/+(A 涡流扩 B 纵向扩 C 传质阻)在前述气相 B=2大 105倍（D 组分在流动相中扩数系数，r 与填充物有关的因素）在 第二项可忽略故高效液相色谱的范氏方程为：H = A + +记：下边解释一般了解即可） 涡流扩散项：A=2- 不规则因子 充物直径） 传质阻抗项引起板高：C=C m+ 忽略。 ，a、引起部分： 忽略数与颗粒内空隙体积分数及容量因子有关。 料直径 分在固定相中扩散系数。 固定相的粒度 物质抗项也有影响b、由流动相引起部分：H m= ,（H 态流动相物1质阻抗项）动相的物质阻抗系数，与填充物质结构有关范氏方程：H=A+ ）s ，H，n2/ 流动相粘度减小， H，n3/ 要使 ，H填充要均匀。 9、柱外展宽：进样器联结管边等死体积越小越好。 210 死全积约 1 H=A+ 可近似认为板高与速成正比（直线关系），H，n，为了兼顾柱效和分析速度，一般采用较低流速，多用1ml/量。 二、分离度及影响因素：2/112又可： 214讨论如何由 n、k 来改变 K， ， R ， k 最适宜范围 18 的碱应用离子对色谱。 制剂弱酸（、弱碱（·缓冲液3、k 及其影响因素：（1） 凡在反向色谱中的影响因素，此处同样影响。 （2） 影响6弱酸：，k,t R(以离子形式为主，流动相中多)弱碱与上恰相反。 之，在 28，超出将会腐蚀仪器，流路系统。 4、用途：（1） 有机弱酸或弱碱与两性化合物的分离。 （2） 有机弱酸或弱碱与分子型化合物的分离。 注意：对于 碱不能用此色谱。 特点表孔硅胶（ 易装柱，柱效不高，柱容量小（10005000）无定形全多孔硅胶（ 柱效高，柱容量大，价廉，但要匀浆 8000胶 球形全多孔硅胶（ 具 优，具涡流扩散小，渗透性好堆积硅珠 传质阻抗小，柱容量大（>800000）第四节 固定相一、LS 色谱1、硅胶：（1） 表孔硅胶：（薄壳玻球 点：易装柱，但柱效不高，柱容量小（10005000）（2） 无定形全多孔硅胶：10 效高，柱容量大，但要匀浆装柱。 价格便宜（80000100000）（3） 球形全多孔硅胶：310具有 优点外，还具涡流扩散项小及渗透性好等特点。 （4） 堆积硅珠：溶胶+凝胶剂聚结而成。 35质阻抗小，柱容量大（>80000）2、高分子多孔小球：（柱效低 10 3）又称有机胶：苯乙烯与二乙烯苯交联而成。 用途：分离芳烃、杂环、甾体、生物碱二、LL 色谱固定相：载体 +固定液（一）机械涂渍（现高效中基本淘汰）（二）化学键合相：7采用化学反应的方法将固定液结合在担体上。 具有吸附与分配双重作用。 优点：不流失，稳定（ 液中不变质） ，热稳定性好，且能用于梯度洗脱。 非极性键合相：键合相表面为非极性基团：八烷基）化学键合相 中等极性键合相：醚基键合相（正反应用流动相极性反应）极性键合相：键合极性基团（氨基、氯基）1、非极性键合相：键合相表面基团为非极性基团。 常用：合相（十八烷基键合相） 载体：全多孔 积硅球，作为 合相与载体。 国产如：8（5，10 m） ， ，10m） 表面覆盖度：参加反应的硅醇基数目占硅胶表面硅醇基总数的比例为表面覆盖度。 其覆盖度的大小，决定键合相是分配还是吸附占主导作用。 具体比例：见 键合基团键长：，载样量，k2、中等极性键合相：醚基键合相 （正、反色谱由流动相极性而定）3、极性键合相：键合极性基团（氨基、氰基）国产品：，10m）（三）离子交换剂经典液相色谱的交换树脂，不耐压，不适用，此处用离子键合相。 载体：薄壳型或全多孔微粒硅胶。 离子交换基团：H，酸型碱型注意：在 的流动相时使用，且要控制一定的离子强度。 当色谱条件一定时，柱交换容量大，保留时间长。 当色谱条件一定时，柱交换容量大，保留时间长。 （四）凝胶：（空间排斥色谱）具有一定孔径的多孔性凝胶。 第五节 流动相8)1(42在 ，溶剂不同，与分子间作用力不同，有可能使组分的 变溶剂的极性，对组分的洗脱能力改变，t R 改变，实验时可适当配比，以至得到较适宜的 R。 对流动相的要求：与固定相反应 2、对样品的溶解度适当（控制 ）3、与检测器匹配 4、粘度小 优化及选择自学（不要求）。 第六节 仪器输液泵进样器色谱柱检测器记录一、输液泵：往复泵 用单头往复泵将涡轮带动涡杆，将宝石柱塞往复推进拉出，推进时两宝石球顶向两边，此时将泵体中流动向输入柱子，拉出时，宝石珠向中间，此时向泵体抽液，如此往复，液体以脉冲形式输入柱子。 仪器改进：双头往复泵 22一泵体向柱输液，另一泵体转到拉液时，一个泵体向柱输液，如此往复，脉冲相互抵消，得到较稳定的流速。 特点：无脉动、流速恒定。 二、色谱柱与进样器：1、进样器：早期用隔膜进样阀，带压进样，操作困难，进样器易反弹出而损坏。 现用六通阀进样器，进样时先与柱流路断开（旋转）将样注入，然后旋至通路，将样带入柱子。 优势：进样量准确，重现性好，可带压进样。 2、色谱柱：由柱管和固定相组成。 柱管：不锈钢管 20常量柱11020常微量柱装柱是一项技巧性很强的技术，它直接影响柱效。 当填料>20m，较易装，干法，轻叩。 粒度<20m ，匀浆装柱。 （先将填料用等密度的有机溶剂匀浆，再高压装柱。 无论装柱还是买柱，要进行柱效检查。 测度条件根据柱类型不同而选用不同的检测。 测出各组分的 W ，t R，求出 n 和 R9 70%三、检测器 荧光 多用 15%示差分析电化学蒸发光散射检测器（一）紫外检测器：优：灵敏度高，精密度、线性范围好，可用于梯度洗脱。 缺：样品组分应吸收紫外光 要考虑溶剂的极限波长1、固定波长型：光源：254压汞灯，此类检测器光源强度大，灵敏度高，检测限可达1×10一种简便实用的检测器。 2、可变波长检测器可选择 似于可见紫外分光光度计） ，将波长调在 最大的进行检测，以增加灵敏度。 （有些配置较好的还可同时扫出紫外光谱） ，现多数 这种检测器。 3、光电二极管陈列检测器：通过吸收池的光经光栅分光 200光的光进入由 500 个单元组成的光电二极管陈列上。 可同时测每隔 1光线，因此 00380及81699谱线瞬间（约 60可测出。 信号经处理后记录仪打出三维空间图，或是平均吸光度色谱图。 优：可鉴别重叠峰，确认峰纯度，比较各峰化学结构，并可从几个通道同时进行峰面积计算，提供最佳定量标准。 （二）其它检测器1、荧光检测器：样品应有荧光，灵敏度比紫外更高。 检测限 1×10差检测器：利用组分与流动相的折射率之差，类似气相热导、利用组分与载气热导率不同，进行检测。 缺：对多数物质检测限较低。 环境、温度对其均有影响。 3、电化学检测器：利用组分氧化还原反应，产生电流或电压变化进行检测。 对还原性物质检10测限 1×10：不能测不能氧化还原的物质。 第七节 定性、定量分析一、定性分析：1、t R: 12相对保留值= 2121、化学鉴定：对 出组分收集，用专属性化学反应对收集的分离物质组分进行定性。 3、联机技术： S、 利叶转换红外光谱二、定量分析：与气相色谱同。 1、外标法：以试样的标准品作对照物质，相对比较求含量。 （1）工作曲线法：（2）外标一点法：（ 与气相同）2、内标法：内标选择同气相。 （1）工作曲线法：在待标准溶液系列中，同体积加入相同量的内标物、进样，分别测出标准物与内标物的 A 或 h，以 s(Ci)s 作图。 （2）内标一点法：在药物分析中，校正因子常常不知，则先配已知浓度标准品，加入一定内标，再将内标按同量加入同体积样品中，分别进样。 （C i%） 样品 = 样 品样 品样 品 %)C()/(、校正因子法：一步：精称被测组分的标准品 一定精称 L 内标 液进样。 由二者峰面积比求出 f；再用待测组分的峰面积与样正因子计算含量。 令 第二步：称一定量样品，加入与测校正因子时相同量的内标物，配液、进11样，测出 s。 %10m称样量注：用校正因子法时，实验条件必须稳定、波长应重现性好。 作业：1、 （定性重复性即 、 （含内标（s）00 结1、了解 个突破。 2、掌握范氏方程与气相中的区别。 3、掌握分离度影响因素。 4、掌握各色谱的原理（ls,，反） ，流出顺序5、固定液与流动相的选择6、仪器：重点：泵、六通阀、检测器7、定性、定量计算：8、色谱（气、液、 ）两个理论 n, n H,同形式。