药学实用仪器分析－液相色谱法

药学实用仪器分析－液相色谱法内容摘要：

药学实用仪器分析－液相色谱法 1色谱法通论§1 概述色谱法是一种重要的分离分析技术。 近年来，由于色谱分析技术的飞速发展。 色谱学已形成一门专门的资料，已成为多组分混合物分离分析的最重要的分析方法之一。 一、色谱法（层析法）定义：利用各组分理化学性质的不同，在流动相流经固定相时，由于各组分在两相间的吸附、分配或其它亲和力的差异而产生不同速度的移动，最终达到分离的目的。 分离基础：差速迁移特点：效率高、灵敏度高，能把性质相近的物质彼此分开，适合于干扰组分存在的混合物的分离分析。 二、分类（一）以两相所处的状态分类：流动相 固定相 类型液 固 谱 液相色谱液 液 谱气 固 谱 气相色谱气 液 谱 （二）按分离机理分类：1、吸附色谱：利用吸附剂表面对不同组分吸附力不同而分离。 (谱、 谱)固定相为固体的色谱。 2、分配色谱：（用各组分在两相间分配系数不同进行分离。 3、离子交换：利用不同组分对离子交换剂亲和力不同分离。 4、分子排阻色谱：利用某些凝胶对不同组分因分子大小不同而阻止作用不同，进行分离。 （三）按操作类型分类：柱色谱：气相、高效、超临界流体、经典柱等等。 2平面色谱：薄层、纸色谱（载体水）逆流分配：属液相色谱、目前已很少使用一、色谱过程：物质分子在相对运动的两相间，分配“平衡”的过程。 前边已讲，其分离机制产差速迁移。 例 顺反偶氮苯在柱中吸附解吸附，再吸 柱中填氧化铝，将正、反体溶解加入柱用流动相冲洗，经吸附，解吸附其流出曲线：二、分配系数与保留行为的关系：1、分配系数：柱中分配平衡后，组分在固定相与流动相中的浓度之比。 K=m S固定相 m流动相 *K 与 T 有关对于不同的分离机理，K 的含意不同。 吸附色谱 称 吸附系数分配色谱 称 分配系数离子交换色谱 称 离子交换系数 统称 分子排阻系数2、保留时间：从进样到某组分色谱峰峰顶的时间间隔，为该组分的保留时间（t R）。 保留体积：从进样到某组分色谱峰峰顶的所需流动相的休积为该组分的保留体积 时间：不保留组分不与固定相作用的组分的保留时间（不溶于固定相或不被固定相吸附）的保留时间为死时间 液动相的保留时间 )。 死体积：样组分，在同样色谱条件下，t R 应相同。 3、t R 与 K 的关系：设 R为一个分子在流动相中的出现的几率，则固定相中 113上式整理后得：1/R=1+K 示溶质分子在流动相中的几率，即溶质分子在色谱柱中的移动速度是流动相分子速度的 1/R倍。 前边已讲 流动相流经柱的时间，t R 为溶质分子流经同样路程时间。 所以 tR=即有：t R=1+K ) t m, m 为定值。 K 呈互性关系。 组分的 K 大，t R 大，后洗脱（后出峰）。 组分的 K 小，t R 小，先洗脱（后出峰）。 混合物中，各组分 K 相差愈大，各组分愈易彼此分开。 那么 K 与什么因素有关呢。 它与组分、流动相、固定相的性质和温度有关。 而在色谱条件一定时，t R 主要取瘊于组分的性质。 因此， 定性参数。 三、分离机制：在分类已简单提了一下，自己学习、后边用到再详细补充讲明。 §4 发展概况（自学）第十章 液相色谱法以液体为流动相的色谱。 §1 柱色谱有吸附柱色谱，分配柱色谱、离子交换色谱等。 一、液体吸附剂：是一些多孔性物质，表面布满吸附点位（吸附中心）吸附：溶质在液- 固两相交界面上集中浓缩的现象。 它发生在固体表面上。 （一）色谱分离过程：xm+xa+y 流动相分子。 到流动相中。 吸附平衡常数：由于流动相分子大量的，所以y mn/yan 可视以常数。 x a/ 吸附常数组分 大， 长。 （组分易被吸附，移行速度慢，保留值就大）。 洗脱曲线：（二）吸附等温线：一定温度下，某组分在吸附剂表面吸附达平衡时，该组分在两相中的浓度相关曲线。 正常峰 拖尾峰 前沿峰1、直线形等温线是理想等温线，其所对应的色谱峰为对称峰。 即吸附剂表面没被溶质所饱和，斜率 K=m 组分流出速度不受浓度的影响。 峰前不变形，后不拖尾。 2、凸型：由于固体吸附剂表面活性不同，大多数液相色谱非线性，且凸型较多。 吸附剂表面具有吸附能力不同的吸附点位，溶质在其表面的分配系数不同。 溶质分子光占据强吸附点位，然后再占据次强的、弱的、最弱的。 强的吸附点位被饱和，在洗脱过程中，被强吸附的溶质洗脱较慢，所以其洗脱峰是拖尾峰。 减少进样量。 3、凹形：由于进样量较大，影响了固定相的物理性质，随溶质量的增加，m。 凹形为防止流出曲线变型，拖尾，应控制溶质进样量。 （三）吸附剂的选择和吸附活度：1、对吸附剂的要求：（1）表面积大，具有一定的吸附能力。 5（2）不应与流动相发生化学反应。 （3）粒度要细，一般要 200 目。 2、吸附剂：常用的有：氧化铝、硅胶、聚酰胺等。 （1）酸性 分离酸性物质 如氨基酸中性 分离生物碱或挥发油 如生物碱碱性 分离的碱性 如生物碱（2）硅胶吸附能力稍弱于氧化铝，用于分离弱酸 性物质。 如有机酸、氨基酸、甾体等。 自由型 束缚型 活泼型吸附力 次之 弱 强分配系数 中 大 小（3）聚酰胺：由酰胺聚合而成的立分子物质。 其吸附原理利用分子内酰胺基和羰基，可与酚、酸、硝基化合物等形成氢键、吸附力与能形成氢键的基团有关。 分对位同位取代均能形成氢键的，吸附力增大，邻位位基团间能形成分子内氢键的吸附力减小。 芳香核具较多共轭键时，吸附力增大。 4、薄层法测 度把柱色谱法配制的染料溶液点在待测的氧化铝薄层板上（软板） ，每种点 2石油醚展开，展距 10察染料该点中心移动距离在 1±此吸附剂为。 例： 种染料5钟即可。 3、吸附剂的活度：氧化铝，硅胶的吸附力大小与其含水量有较大关系。 活度级数 含水量 活度 吸附能力小 小 大 强大 多 小 弱加热除水，活度提高，吸附力加强。 加一定水，活度下降，吸附力减弱。 6活化：105110 左右加热除水为活化。 脱活：加入一定水份降低活性。 （四）流动相的选择：流动相又称洗脱剂，展开剂的移动相。 要求：（1）纯度高 （2）稳定（对样品和吸附剂不反应） （3）对样品溶解度大 （4）粘度小（易洗脱）流动相的洗脱实质上是流动相分子与被分离分子竞占吸附剂表面活性中心的过程。 选择流动相应考虑三个方面：1、被分离物质的极性与结构：（1） 基本母核相同，基团极性愈大，分子极性基本母核相同，极性基团数目，分子极性基团极性大小顺序 2） 分子双键多，吸附力，共轭度，吸附性。 （3） 空间排列：影响极性。 2、吸附剂的活度：被分离物质的极性 吸附剂活度 流动相极性大 应选 小 防吸附太牢，难洗脱小 大 防 小，不易分离。 3、流动相：相似相溶原则：讲时板书与上联为一个表格被分离物质极性 吸附剂活度大 小 大小 大 小常用流动相极相强弱顺序：于使用哪种，要由实验来摸索，流动相选择活度很大，往往可用一元配两元或三元也可采用梯度洗脱等技术。 二、配柱色谱：（不讲，在 讲）1940 年，丁（英） 分配色谱获诺贝尔奖金1952 年，再度合用，发明气相色谱。 7（一）原理：有些强极性化合物，能被吸附剂强烈吸附，即使使用洗脱能力很强的流动相也难推动，从而使吸附色谱无法分离，为克服之，发明了液用混合物中各组分在两相中溶解度不同而达到分离。 K=m（二）载体 固定相与流动相：载体（担体）：惰性物质，要有较大的表面积（起马我固定液的作用）硅胶、纤维素、硅藻土等。 固定相：水、甲醇、甲酰胺等。 流动相：与固定相不相混溶的有机溶剂，可以单一，亦可混合液，用之前先固定相饱和，以防固定相流失。 （三）正相色谱与反相色谱正相 反相固定相极性 大 小流动相极性 小 大流出顺序 极性小的组分先流出 极性大的组分先流出三、离子交换色谱：固定相：离子交换树脂 分离对象：离子化合物流动相：水溶液与缓冲液 分离机制：差速迁移（一）树脂分类：具有网状的立体结构的高分子聚合物。 联上酸性基团：阳离子交换树脂（H，H 等）骨架 联上酸性基团：附离子交换树脂（，）阳离子交换反应：交换n n+ =(nM+生（用酸标液电 求 x%）（阴离子树脂的再生，用适当的碱液浸泡）。 8（二）树脂的性能：1、交联度：交换树脂中，交联剂的含量为交联度，以重量百分比表示。 交联度 网眼 交换 体积大的离子大 小 慢 不易进入选择性好，但慢小 大 快 大小离子均可进入阳离子交换树脂一般交联度 8%（常用）阴离子交换树脂一般交联度 4%2、交换容量：每克树脂能参加交换反应的活性基团数单位：g, 映树脂交换反应的能力)3、粒度：以溶胀态所能通过筛孔来表示。 1020 目 交换水用100200 目 分析用三影响离子交换的因素：1、交换度与交换容量： 大 2、流动相的组成和 解受到抑制，则 短3、溶质离子的电荷与水公半径。 三离子交换平衡常数：1、R B+=A+= rB+r, A+r 分别表示树脂中 A、B 离子的浓度；A+，B +分别表示水液中 A、B 离子的浓度；若：K B/A>1，说明 B+较单纯地结合在树脂上<1，说明 A+较早地结合在树脂上K B/A 说明了树脂对 A+、B +两种离子选择性交换的能力，故亦称之为选择性系数。 9，B 与树脂结合能力强，洗脱慢，t R。 = 即：分配系数不同是离子交换分离的先决条件。 3、影响 的因素： 随交联度 而增大，还与被交联离子半径有关。 （1） 强酸性聚苯乙烯阳离子交换树脂：同价离子，浓度同时，随原子量增加与树脂亲和力增大。 不同价态离子，价态高的离子亲和性大，即选择性大。 （2） 弱酸性阳离子交换树脂：与（1）顺序有所不同。 学）§2 薄层色谱法 板活化点样饱和展开显色定性定量。 一、原理将混合组分的试液，点在铺了吸附剂的玻板一端，在密闭容器中用适当的溶剂（展开剂，流动相）展开，各组分不断地被吸附，解吸附随展开剂前移，利用吸附剂对不同组分的吸附力（吸附常数）不同，产生差速迁移，而达到分离。 特点：快速 灵敏（克） ，高选择 显色方便。 二、参数（一）定性参数比移值 到 溶 剂 前 沿 距 离原 点 到 斑 点 中 心 的 距 离 f=0 未移行（被固定完全吸附，K） 移至前沿（组分不被固定相吸附 K0）一般：0R f110同一色谱条件下，同样结构的分子有相同的（例：物质，当色谱条件一致时，R 性用，但重视性差，有人建议用相对比移值定性。 参加班可是另加的物质，亦可以样。