生物制药工艺学－固相析出分离法

生物制药工艺学－固相析出分离法内容摘要：

生物制药工艺学－固相析出分离法 第五章 固相析出分离法 通过改变溶液条件，使溶质以固体形式从溶液中分出的操作技术。 盐析法 有机溶剂沉淀法 等电点沉淀法 结晶法1第一节 盐析法 (义：盐析法是利用各种生物分子 在浓盐溶液中溶解度的差异 ，通过向溶液中引入一定数量的中性盐，使 目的物或 杂蛋白 以沉淀 析出 ，达到纯化目的的方法。 优点：简单、经济、较少变性缺点：分辨率不高，要除盐2两种现象：盐溶 ：低盐情况，盐离子强度的增高，蛋白质溶解度增大盐析 ：高盐，盐离子强度增加，蛋白质 溶解度减小32 . 52 . 01 . 51 . 00 . 50- 0 . 5- 1 . 0- 1 . 51 2 3 4 5 6本原理4原理 形成 离子对 ，部分中和了蛋白质的电性，排斥作用减弱而能相互靠拢，聚集起来。 中性盐的亲水性比蛋白质大，使蛋白质脱去了 水化膜 ，使其沉淀。 5在盐析区，符合公式蛋白质溶解度 ， g/L；盐离子强度 , ；常数 ,为纵坐标上的截距 ;盐析常数。 62 . 52 . 01 . 51 . 00 . 50- 0 . 5- 1 . 0- 1 . 51 2 3 4 5 6 为纵坐标上的截距， 是外推截距 ，与无机盐种类无关。 与蛋白质和盐的种类有关，但与温度和 两种类型：（ 1）在一定的 浓度）进行盐析，称作 （ 2）在一定离子强度下仅改变 作 盐析法。 7（一）、无机盐的种类盐析能力：半径小的高价离子在盐析时的作用较强 ， 阴离子的盐析效果比阳离子好 ， 尤其以高价阴离子 更为明显。 - I K+ 析用盐要考虑几个因素：常用硫酸铵8二、影响盐析的因素(二）溶质（蛋白质等）种类的影响血 纤 维蛋 白 原碳 氧 血红 蛋 白血 清 白蛋白拟 球 蛋 白碳 氧 肌红 蛋 白0 . 5 00- 0 . 5 0- 1 . 0 00 2 4 6 8 1 0）蛋白质浓度的影响 蛋白质浓度提高，盐用量减少。 111098765432104 0 5 0 6 0 7 0 8 0 g / L 3 g / L（四）温度的影响 温度的变化会影响 值。 在无盐或稀盐溶液中，大多数蛋白质溶解度是随温度升高而增大的，但在 高盐溶液中常相反。 12210 3 4 25 0p H 6 . 6（五） 当溶液的 值最小。 利用 值最低点时 以分级沉淀蛋白质 . 13卵 清 蛋 白碳 氧 血 红 蛋 白765432103 4 5 6 7 8析操作（一）盐析用盐的浓度表示固体粉末硫酸铵饱和溶液常用 “ 饱和度 ” 来表征硫酸铵在溶液中的最终浓度， 25 时 (.1 L，定义它为 100%饱和度 5（二）盐析方法和注意事项1、 分部盐析法2、重复盐析法3、 反抽提法一定的盐浓度下将 目的蛋白夹带一定量的杂蛋白一同沉淀。 将沉淀用较低浓度盐溶液平衡，溶出其中的杂蛋白。 16分部盐析法17反抽提法 (18注意事项 “局部过浓 ” 温度 （室温） 分离方法19第二节 有机溶剂沉淀( 定义：向水溶液中加入一定量 亲水性 的有机溶剂，降低溶质的 溶解度 ，使其沉淀析出的分离纯化方法。 201、降低了介质的 介电常数 ，使溶质分子之间的静电引力增加，聚集形成沉淀。 2、水溶性有机溶剂本身的 水合作用 降低了自由水的浓度，压缩了亲水溶质分子表面原有 水化层的厚度 ，降低了它的亲水性，导致脱水凝集。 21一、基本原理一些溶剂的介电常数22 优点：乙醇等有机溶剂易除去，产品更纯净；密度差较大，离心收集。 缺点：容易使蛋白质变性，操作常需低温，成本高，需 防火防爆。 23二、影响沉淀效果的因素（一）有机溶剂种类及用量常用的溶剂有乙醇、丙酮、甲醇等。 （二） 液 电点附近 ，还须考虑蛋白质的稳定性。 24（三）温度（ 低温沉淀 ）有机溶剂存在下，大多数蛋白质的溶解度随温度降低而显著地减小。 （四）无机盐的含量低盐：有利于沉淀，还有保护蛋白质，防止变性。 高盐 ：增大蛋白质在有机溶剂 水溶液中的溶解度，沉淀物中可能夹带盐。 25多价阳离子，如 与蛋白质结合形成复合物，使蛋白质溶解度降低。 胰岛素精制：26（五）某些金属离子的助沉淀作用（六）样品浓度浓度小时，增加溶剂投入量和损耗。 浓度大时，增加共沉作用，降低分辨率。 蛋白质浓度 2%；粘多糖浓度 1% 2%。 27第三节 其它沉淀方法一、等电点沉淀法对于两性物质，等电点时净电荷为零， 分子间排斥电位降低 ，吸引力增大，能相互聚集起来，发生沉淀。 杂蛋白28 胰岛素纯化： 胰岛素 除去碱性杂蛋白 除去酸性杂蛋白29金属离子沉淀：与生物分子的 酸性功能团 作用的 金属复合盐法 ；有机酸类复合盐沉淀 :与生物分子的 碱性功能团 作用的 有机酸复合盐法 （如苦味酸盐、苦酮酸盐、丹宁酸盐等）。 30二、成盐沉淀法1金属离子沉淀： ；2生成有机酸类复合盐沉淀（ 1）丹宁即鞣酸（ 2） 雷凡诺（ 3） 三氯乙酸 （ 1雷凡诺32猪心提取液 洗脱液上清液 上清 细胞色素 除）33吸附人造沸石盐析45%饱和硫酸铵沉淀和沉淀利用亲和反应原理，将配基与可溶性的载体偶联后形成 载体 和沉淀剂） ，该复合物可选择性地与蛋白质结合，在一定条件下沉淀出来。 中性可溶，酸性沉淀。 3435四、 高分子聚合物沉淀水溶性非离子型高分子聚合物，如不同分子量的聚乙二醇（ 葡聚糖、右旋糖苷硫酸酯等，能使 蛋白质水合作用减弱而发生沉淀。 五、表面活性剂十六烷基三甲基季胺溴化物（ 六烷基氯化吡啶（ 6 酸性多糖37六、选择性变性沉淀法 热变性沉淀法 酸碱变性沉淀法 利用试剂（氯仿）38固相析出分离法 第一节 盐析法 第二节 有机溶剂沉淀 第三节 其它沉淀方法 一、等电点沉淀法 二、成盐沉淀法39第四节 结晶 ( 定义： 溶液中的溶质在一定条件下因分子有规则的排列而结合成晶体。 通过结晶，溶液中的大部分杂质会留在母液中，经过滤、洗涤可得到 纯度高 的晶体。 40一、结晶过程指溶质自动从 过饱和溶液 中析出形成新相的过程。 小晶体的溶解度 ； 普通晶体的溶解度； 晶体密度； M 晶体质量； 晶体与溶液间的界面张力； 2 小晶体的半径 ； 1 普通晶体的半径；41)11(2结晶包括三个过程：(1) 形成 过饱和溶液 ;(2) 晶核形成 ;(3) 晶体生长。 42浓度温度图43二、过饱和溶液的形成 (结晶方法 )（一）、蒸发法（二）、 温度诱导法热盒技术（三）、 盐析结晶法（四）、 透析结晶法（五）、有机溶剂结晶法44温度诱导法45盐析结晶法46透析结晶法47（六）、 等电点法（七）、微量扩散法（八）、 化学反应结晶法调节溶液的 应剂 ，生成新物质，结晶析出。 （九）、共沸蒸馏结晶48等电点法49化学反应结晶法50综合利用51三、提高晶体质量的途径工业上通常希望得到 粗大而均匀 的晶体，便于过滤与洗涤。 （一）、晶体大小影晶体大小的主要因素有 过饱和度、温度、搅拌速度、晶种 等。 52晶种53（二）、晶体形状改变晶体外形，可用 :选择不同的溶剂、 控制过饱和度、 结晶温度 、调节溶液的 三）、晶体纯度晶体表面具有一定的物理吸附能力。 重结晶： 即将晶体用合适的溶剂溶解再次结晶。 54重结晶 ( 溶解度受温度影响较大的物质，将产品溶解在 热的溶剂 中，缓慢降低温度析出晶体。 将溶质溶于一种溶剂中，然后将第二种溶剂加热后缓缓地加入，放置一段时间使结晶完全。 55红霉素重结晶56用于生物物质重结晶的溶剂一般有 蒸馏水 、 丙酮、石油醚、乙酸乙酯、低级醇 等。