生物制药工艺学－亲和纯化技术

生物制药工艺学－亲和纯化技术内容摘要：

生物制药工艺学－亲和纯化技术 第九章 亲和纯化技术 利用生物分子间的 特异性结合作用 的原理进行生物物质分离纯化的技术称为 亲和纯化技术 （ 23技术要点 （ 1）找与底物 专一可逆结合 的配基； （ 2）将配基通过 共价键 偶联到基质； （ 3）配基 与 底物 吸附 ； （ 4）洗脱目标物。 4亲和纯化技术 亲和层析 ( 亲和过滤（膜分离） 亲和分配（双水相萃取） 亲和反胶团萃取（反胶团萃取） 亲和沉淀（沉淀） 亲和电泳（电泳）5第一节 亲和层析( 利用生物大分子物质具有与某些相应的分子 专一性可逆结合 的特性而建立的层析技术。 适用于从成份复杂且杂质含量远大于目标物的混合物中提纯目标物。 6特点 经过一次处理可得到 高纯度活性 物质 ； 设备要求不高 、 操作简便 、 特异性强 、 分离速度快 、 分离效果好 、 分离条件温和 ； 亲和吸附剂通用性较差 ， 专用的吸附剂。 7亲和吸附剂：载体 配基 在亲和层析中起可逆结合的特异性物质称为 配基（ 与配基结合的层析介质称为 载体（ 8一、亲和层析的原理 （ 1） 配基固定化 ：配基与 载体 偶联 ， 结合成具有特异亲和性的分离介质。 （ 2） 吸附样品 ：亲和层析介质选择性吸附生物活性物质 .（ 3） 样品解吸 ：选择适宜的条件使被吸附物活性物质解吸。 9二、亲和层析载体（ 一 ） 、 亲和层析对载体的要求： （ 1） 充分 功能化 ， 与配基进行共价连接。 （ 2） 有较好的 理化稳定性和生物惰性。 （ 3） 具有高度的 水不溶性和亲水性。 （ 4） 具有 多孔的立体网状结构。 （ 5） 应为 大小均匀 的刚性小球。 10（二）、常用载体 纤维素 ( 琼脂糖凝胶 葡聚糖凝胶 聚丙烯酰胺凝胶 多孔玻璃珠（ 其它载体 壳聚糖 (11、纤维素 纤维素 结构紧密 、均一性差，不利于大分子的渗入。 非特异性吸附力较强， 空间位阻。 主要用于 分离与核酸有关的物质。 122、 琼脂糖凝胶 琼脂糖浓度有 2%、 4%、 6%，商品为B、 4B（ 保持吸附物质活性，能迅速活化并接上各种功能基团，结构疏松 孔径大，流速快。 L,稳定性明显增加，能在4中应用。 13 3、 葡聚糖凝胶： 葡聚糖凝胶孔径太小 ，偶联配基后，孔径更小，应用受到限制。 4、 聚丙烯酰胺凝胶： 有供化学反应的 酰胺基 ， 能制得配基含量较高的亲和柱 ， 适用于亲和势比较低的系统。 14 5、 多孔玻璃珠： 化学与物理稳定性 较好 ， 机械强度高。 缺点：亲水性不强 ， 对蛋白质尤其是碱性蛋白质有 非特异性吸附 ， 化学活性基团少。 6、 其它载体 壳聚糖15壳聚糖 (甲壳素和壳聚糖 )16三 、 亲和配基 配基的选择 配基的 浓度 配基偶联的 位置 配基分子的 大小 配基的 类型17（一）、配基的选择 亲和层析配基的选用主要取决于分离对象。 1、配基与配体有足够大的亲和力 （亲和势）， 1010 2、配基与配体的结合应是专一的。 3、配基应具有化学活性。 18亲和势 19（二）、配基的浓度 对亲和势比较低的时候 （ 0） ，增加 配基浓度 有利于吸附。 增加 亲和柱的长度 来提高吸附率。 配基浓度太高使吸附力太强 ， 洗脱困难。 理想的配基浓度为 1。 20（三）、配基偶联的位置 配基固定化时 ， 其 不参与亲和结合的部位与载体进行偶联。 腺嘌呤 到载体上 ， 对脱氢酶和甘油激酶有吸附力。 磷酸基 接到载体上 ， 对甘油醛 21（四）、配基分子的大小 选用 大分子配基。 甘氨酸 小分子物质作为配基，载体和配基间插入一个 “手臂” 以消除空间障碍。 22（五）、配基的类型 较小的有机分子或天然生物活性物质。 根据配基应用和性质 :特殊配基和通用配基。 特殊配基 （ 3通用配基（ 用于一类物质的分离提纯。 用 氢酶 类亲和层析的通用配基； 用 用 外源性凝集素 作 糖蛋白类 亲和层析时的通用配基等。 24四、 载体的活化与偶联 糖类载体的活化与偶联 聚丙烯酰胺凝胶及其它凝胶衍生物活化与偶联 用于固定化配基的凝胶衍生物25（一）、糖类载体活化与偶联 溴化氰 活化法 高碘酸氧化法 环氧化法 甲苯磺酰氯法 双功能试剂法26溴化氰活化法 载体如琼脂糖 、 葡聚糖等 ， 在碱性条件下用 溴化氰 处理 ， 可引入活泼的 “ 亚氨基碳酸 ” 中间体。 在弱碱的条件下直接与 含有游离脂肪族氨基或芳香族氨基的配基 偶联。 27方法28高碘酸氧化法 多糖载体与 的 高碘酸钠 氧化反应 24小时会产生醛； 在温和条件下 ， 醛与赖氨酸上的 夫碱 ， 接着用硼氢化钠还原 ， 生成稳定的 烷基胺。 29环氧化法 碱性条件下 ， 多糖载体与 环氧氯丙烷 作用生成环氧化合物； 环氧化合物又与 氨基酸或蛋白质上氨基偶联。 30甲苯磺酰氯法 甲苯磺酰氯法 在无水丙酮中进行。 优点：活化反应迅速； 偶联条件温和； 偶联效率高。 31双功能试剂法 双功能试剂 是同一分子中具有 两个反应活性基团 的化学试剂 ， 常作为连接两个分子的 “ 桥梁 ”。 二乙烯砜 、 戊二醛 、 琥珀酸酐 优点：反应速度快 、 条件温和 ， 能与氨基 、 糖类 、酚 、 醇类等偶联。 32（二）、 聚丙烯酰胺凝胶及其它凝胶衍生物活化与偶联 叠氮化法 重氮化法 (含氨基载体 ) 碳二亚胺缩合法（含羧基载体）33聚丙烯酰胺凝胶载体的活化法 有大量可修饰的 酰胺基。 酰胺基能被 含氮化合物 置换制备多种衍生物。 34叠氮化法 聚丙烯酰胺的 酰肼衍生物 ， 加 1的亚硝酸 ， 反应液搅 90s； 加入 脂肪胺类配基 ， 制得亲和吸附剂。 35重氮化法 对硝基苯甲酰氯反应 ， 制得对硝基苯甲酰胺烷基琼脂糖衍生物。 用连二亚硫酸钠还原 ， 亚硝酸钠处理 ， 得 重氮盐衍生物。 配基与重氮盐衍生物偶联 ， 制得亲和层析柱。 36碳二亚胺缩合法 碳二亚胺为羧基活化剂。 反应中的脲衍生物可用有机溶剂洗涤除去。 37（三）、用于固定化配基的凝胶衍生物1、 B 可偶联蛋白和核酸类配基。 2、 个碳原子的 ” 手臂 ” 的琼脂糖衍生物 38393、环氧活化型 B 由亲水 “ 手臂 ” 与 用于 小分子配基的固定化。 用于偶联脂多糖、蛋白等大分子配基。 404、活化型亲和胶 10和 15 由 琼脂糖衍生物形成的活化酯。 手臂 ” 长为 10个碳原子 ， 产生一些负电荷 ， 有利于碱性或中性蛋白偶联 ； 5个碳原子的 “ 手臂 ” ， 产生一些正电荷 ，故 有利于酸性蛋白的偶联。 415、 、亲和胶 202和亲和胶 102 ， 无 “ 手臂 ” 的 羧基衍生物 ； 02具有 6个原子 “ 手臂 ” ， 未端为氨基。 0个原子的 “ 手臂 ” ， 未端具有羧基；42五、 影响吸附亲和力的几个因素配基浓度 对亲和力的影响 空间障碍 的影响 配基与载体的 结合位点 的影响 载体孔径 的影响 微环境 的影响43（一）、配基浓度对亲和力的影响 为将亲和配体与其它物质分开 ， 需要 阻留值10。 配基浓度 与 亲和对解离常数 相关。 对于低亲和力系统 ， 配基浓度。 44（二）、空间障碍的影响 空间位阻。 对于 分子大的配体 以及 小分子配基 更明显。 “ 手臂 ” ， 增加与载体相连配基的活动度 ， 减轻载体的立体障碍。 常用的 “ 手臂 ” 多为烃链。 45（三）、配基与载体的结合位点的影响 多肽或蛋白质等大分子配基 须 控制偶联 反应 条件 ， 使它以 最少的功能基团与载体连接。 保持蛋白质原有的 高级结构 ， 使亲和吸附剂具有较大的亲和力。 46 （ 四 ） 、 载体孔径的影响 载体孔隙是配体向配基接近的通道。 孔径大小 对吸附剂亲和能力有影响。 （ 五 ） 、 微环境的影响 载体及 “ 手臂 ” 的 电性 、 极性 对亲和力的影响。 避免引入离子键的基团。 疏水作用 的存在 ， 会引起 非特异性吸附 作用。 47六、 配基与间隔臂的连接 （一）、含氮配基的连接 （二）、含羧基配基的连接 （三）、含巯基配基的连接 （四）、含醛基、酮基、羟基配基的连接48七、 亲和层析的吸附和洗脱 影响 吸附 的条件 亲和层析的 洗脱 亲和吸附剂的再生49（一）、影响吸附的条件 亲和吸附剂及配体的性质 缓冲液的种类 、 离子强度 、 温度和层析流速有关。 温度 升高会使吸附作用减弱。 流速 每小时低于 10 ml/ 层析柱用前必须充分平衡。 上样体积 为柱床体积的 5%。 50非专一性吸附 亲和层析中的非专一性吸附。 离子效应 疏水基团 复合亲和力51离子效应 配基与 载体 不完全结合 ， 将无关 离子基团引入 吸附剂。 具有 离子基团 的亲和吸附剂会影响蛋白质的洗脱行为。 52疏水基团 吸附剂疏水性基团与蛋白质结构中的疏水区相互吸引 ， 形成 非专一性吸附。 疏水基团： （ 1） 长的烃链结构的 “ 手臂 ” ： （ 2） 疏水性配基：53复合亲和力 离子效应 作用 ， 又有 疏水作用。 配体与配基有较强生物特异性。 用 高浓度的盐 和 有机溶剂 ， 以提高选择性。 54（二）、亲和层析的洗脱 洗脱： 洗脱方法主要有三种： 非专一性洗脱 特殊洗脱 专一性洗脱55非专一性洗脱 改变 洗脱剂的 离子强度的 分步和梯度变化 . 亲和势很高 ， 促溶离子 ， 其洗脱能力的强弱。