生物制药工艺学－凝胶层析

生物制药工艺学－凝胶层析内容摘要：

生物制药工艺学－凝胶层析 第七章 凝胶层析(2凝胶层析 ( 分子筛层析 、 凝胶扩散层析 、 排阻层析 、 限制扩散层析等。 是将样品混合物通过一定孔径的凝胶固定相 ，由于各组分 流经体积 的差异 ， 使 不同分子量的组分得以分离的层析方法。 3第一节 凝胶层析的基本原理 凝胶层析的分离过程是在装有多孔物质填料的柱中进行的。 柱的总体积为 它包括填料的 骨架体积 填料的孔体积 水体积 )以及填料颗粒之间的体积 外水体积 ）。 1+当具有一定分子量分布的高聚物溶液从柱中通过时 ， 较小的分子在柱中停留时间比大分子停留的时间要长 ， 于是样品各组分即按分子大小顺序而分开 ，最先淋出的是最大的分子。 0+d ）平衡排除理论 当溶质层流过一个填料颗料这段距离时 ， 溶质分子已多次进出于填料的孔 ，达到平衡。 平衡条件只是在流速很慢时的一个极端情况。 7（二） 扩散分离理论 溶质分子在流经色谱柱的过程中 ， 在流动相和固定相之间没有达到平衡 ， 存在着 流速依赖性。 聚苯乙烯和苯乙烯样品淋出曲线的流速依赖性1流速为 流速为 ） 流动分离理论 红细胞在毛血细管中流动时比血浆流得快 . 较大的分子较先通过或绕过这个填料颗粒，使溶质能按其大小进行分离。 9分离过程 三种不同分子量物质的混合样品用某种规格的凝胶柱进行分离。 样品加入，以水或其他溶液进行洗脱，即得洗脱曲线。 10分离过程 最先流出物质 A， 完全不能进入颗粒内部 ， 只能从颗粒间隙流过 ，“ 全排阻 ”。 其流经体积最小 ， 等于外水体积 最后流出物质 C， 它 分子量最小 ， 其分子可以 自由进出凝胶颗粒 ， “ 全渗入 ”。 流经体积是外水体积与内水体积之和 i。 物质 其分子能够部分地进入凝胶颗粒中。 “ 部分排阻 ” 或 “ 部分渗入 ”。 流径体积 体 积 加 上 内 水 体 积 的 一 部 分 ， 即0+d 排阻系数： 当 时 ， 洗脱体积 0+为全渗入。 当 时 ， 洗脱体积 0， 为全排阻。 0 1时 ， 洗脱体积 o+为部分渗入。 12物质的 （ 1） 凝胶层析操作简便 ， 所需设备简单。 （ 2） 分离效果较好 ， 重复性高。 （ 3） 分离条件缓和。 （ 4） 应用广泛。 （ 5） 分辨率不高 ， 分离操作较慢。 14第二节 凝胶的结构和性质 一、 葡聚糖凝胶 ( 二、修饰葡聚糖凝胶 ( 三、 聚丙烯酰胺凝胶 （ ） 四、 琼脂糖类凝胶 （ 五、多孔玻璃微球 ( 六、疏水性凝胶 （ 5一、葡聚糖凝胶 ( 商品名为 类 . 交联葡聚糖的基本骨架是葡聚糖。 再经 31， 2形成三维网状结构的高分子化合物。 其 交联度是通过交联剂的加量及反应条件来控制的。 16 编号意义： 1、 吸液量； 2、 溶涨时间； 3、 凝胶孔径 ； 4、 分离范围 蛋白质 、 多糖17葡聚糖凝胶性能与编号的关系编号 交联度吸液量 膨胀速度凝胶孔径分离限 凝胶强度大（ 150 ）小 大 慢 大 大 小小（ 50 ）大 小 快 小 小 大18葡聚糖凝胶（ 规格19葡聚糖凝胶（ 点 1、 孔径。 2、 稳定性。 3、 吸附作用。 4、 芳香族化合物和杂环化合物。 20保存 保存的方法有 干法 、 湿法和半缩法 三种。 湿法：加入一定量的防腐剂置于冰箱中作短期保存 （ 6个月以内 ）。 常用 氮化钠 、 氯叔丁醇 、 20%乙醇等。 干法：用浓度逐渐升高的乙醇分步处理洗净的凝胶 ， 脱水收缩 ， 抽滤 ， 用 6080 吹干。 半缩法：21二、修饰葡聚糖凝胶( （ 一 ） 亲 脂 性 葡 聚 糖 凝 胶 （ 骨架结构上引入一些有机基团 ， 如甲基 、 羟丙基 ， 使呈亲脂性 ， 同时保留亲水性。 （ 二 ） 交联葡聚糖离子交换剂 （ 将活性交换基团连接于葡聚糖凝胶上制成的各种交换剂。 22交联葡聚糖离子交换剂23 （ 三 ） 由高交联度多孔琼脂糖与葡聚糖共价结合而成。 （四） 是由烯丙烷基葡聚糖经甲叉双丙烯酰胺共价交联制成的。 理化稳定性好，为硬性凝胶，可耐高压灭菌。 24丙烯酰胺凝胶 商品名为 生物凝胶。 该凝胶由 丙烯酰胺 组成；以 亚甲基双丙烯酰胺为交联剂 ， 聚合而成。 特点 ：1、 孔径；2、稳定性、强度；3、无非特异吸附，保存方便；4、 编号反映出它的分离界限。 27聚丙烯酰胺凝胶的性质 生物凝胶的编号反映出它的分离界限。 如 8四、琼脂糖类凝胶（ （ 一 ） 琼脂糖凝胶 结构是由 3， 63429琼脂糖凝胶特点 1、 没有共价键的交联。 2、 孔径 琼脂糖的浓度。 3、 琼脂糖凝胶的化学稳定性较差。 4、 非特异性吸附力低。 5、 分离范围大。 6、 颗粒强度差。 30琼脂糖凝胶分离范围琼脂糖凝胶有 3个规格： 4B、 6%， 4%， 6%。 31几种蛋白质 ）架桥琼脂糖凝胶（ L） 架桥琼脂糖凝胶为琼脂线性分子经 1， 3联的凝胶。 它的凝胶孔径均匀 ，机械强度 明显加大。 对热和化学物质的稳定 性 大 大 增 加 , 在4范围内稳定。 33）超胶（ 所谓超胶是 琼脂糖与聚丙烯酰胺 的混合凝胶。 商品名称后面的编号为两位数 ， 各 表示混合胶中聚丙烯酰胺与琼脂糖的百分浓度。 35（四） 是由珠状琼脂糖经两次交联制得的可用于 速 凝胶过滤介质。 有 6%和 12%两个规格。 36五、多孔玻璃微球 ( 特点： 1、 化学稳定性高 、 强度大。 2、 对糖类 、 蛋白质等物质有吸附作用。 3、 编号表示其 孔径 , 越大 ， 分离分子量也越大。 37六、疏水性凝胶（ 聚甲基丙烯酸酯凝胶和聚苯乙烯凝胶。 分离范围为 1 600 40 000 000。 生物珠 （ ），适于分离分子量较小的物质。 分离不溶水的有机物质。 38常用的商品化凝胶介质39一第三节 凝胶层析的实验条件和操作4041第三节 凝胶层析的实验条件和操作 一、凝胶的选择和处理 二、凝胶层析柱的设计和制备 三、凝胶层析操作 四、主要参数测算42一、凝胶的选择和处理 （ 一 ） 凝胶的选择 (1) 如蛋白质与盐类 ， 称作 类分离 或组分离。 (2) 如分离血清球蛋白与白蛋白 ， 这叫做分级分离。 431类分离 （ 1） 使大分子的分配系数 ； （ 2） 小分子的。 选用 分离范围 1000 5 000。 442分级分离 （ 1）使各种物质的 （ 2）不使分子量分布在凝胶分离范围的一侧。 （ 3） 分子量大于渗入限的 3倍 ，并 小于排阻限的 1/3。 如用 效果要比 5（二）凝胶粒度的选择 细粒凝胶柱流速低 ， 洗脱峰窄 ， 分辨率高 ， 用于精制分离或分析。 粗粒凝胶柱流速高 ， 洗脱峰平坦 ， 分辨率低 ，用于粗制分离 ， 脱盐。 46（三）凝胶的预处理 使用前须 溶涨 ，使干胶颗粒充分吸收溶剂，并达到平衡。 干胶以 10倍以上吸液量的溶剂浸泡。 热法溶涨 (水浴 )。 47二、凝胶层析柱的设计和制备 （ 一 ） 层析柱的选择 层析柱长度与直径的比值称作 “ 柱比 ”。 对于类分离 ， 柱床体积一般为样品溶液体积的 5倍 ， 柱比 5:1到 10:1即可。 对于分级分离 ， 则要求柱床体积大于样品体积 25倍以上 ， 甚至多达 100倍。 柱比在 25至100之间。 48凝胶柱床大小与所需凝胶量的关系49（二）凝胶柱的装填 常用的 支持物 有棉花 、 玻璃纤维 、 玻璃珠 、 垂熔玻璃等。 空柱中应留约 1/5的水或溶剂 . 不断搅拌下使胶粒 均匀沉降 ， 使不发生凝胶分层和胶面倾斜。 50（三）凝胶床的检查和维护 观察有无凝胶分层 、 沟流和气泡等现象。 有色物质溶液过柱 ， 观察柱床有无沟流 ，色带是否平整。 检查物质为 蓝色葡聚糖。 51操作压层析柱由于进出口之间液位压力差形成的对凝胶颗粒的压力称作 “ 操作压 ”。 52层析床横截面所允许的最大压力53三、凝胶层析操作 （ 一 ） 样品和加样 蛋白质类样品浓度 :不大于 4%。 加样时应尽量减少样品的稀释 ， 及凝胶床面的搅动。 样品粘度对洗脱曲线的影响柱：交联葡聚糖 4× 85速 180ml/h；样品： 红蛋白 +化钠；（ 1）相对粘度为 2）相对粘度为 3）相对粘度为 （ 1）直接将样品加到层析床表面。 （ 2）样品 比重高。 55（二）洗脱与收集 1、 洗脱剂。 2、 流速 （ 操作压 、 型号 、粒度 ）。 3、 分部收集器。 56（三）凝胶柱的再生 反冲。 重新装柱。 57四、主要参数测算 分辨率 ） 1 重量法 o+g = /4·i=g·t （ g） 2 过柱法 已知。