生物制药工艺学－基因药物

生物制药工艺学－基因药物内容摘要：

生物制药工艺学－基因药物 第四节 基因药物一、基因治疗的概念1、基因治疗的定义 :(基因治疗是将人的正常基因或有治疗作用的基因导入人体靶细胞以纠正基因的缺陷或发挥治疗作用，从而达到治疗疾病目的的生物医学新技术。 而用于基因治疗的核酸等称为基因药物（ 未形成概念前， 20世纪 70年代就开始临床实验，由于实验未取得成果，而且没有得到 受抨击。 80年代，在动物身上进行了大量试验，为其临床应用奠定了基础。 1990年 9月，临床实验正式开始。 患者是一名患严重联合免疫缺陷症的年轻姑娘，她从父母处各继承了一个缺陷的 成体内缺乏腺苷酸脱氨酶。 我国复旦大学的薛京伦研究小组，做了世界上首例血友病 基因治疗。 成功地对先天性重症免疫缺陷症进行基因治疗的法国基因治疗组组长艾伦 ·费希尔博士（左）和成员玛丽娜 ·卡巴甘那卡勃博士（右）。 2002年 10月 ,一名法国男孩在接受试验性基因治疗后罹患白血病，而基因治疗很可能是白血病发病的原因。 非常希望这种基因治疗方法从总体而言利大于弊。 除基因治疗之外，治疗 非骨髓移植非常匹配，否则手术的失败率是 25%。 他强调说，这一失败率比现在接受基因治疗的 11例患者的并发症发生率高 2倍以上。 从基因角度：对缺陷的基因进行原位修复用正常有功能的基因置换有缺陷的基因增补缺陷基因 （不需要去除异常基因，而是另外转入与缺陷基因同源的有功能的基因来弥补缺陷的基因） 从治疗角度导入基因以改变患者细胞的基因表达导入基因： 缺陷基因相对应的有功能的 同源基因 缺陷基因无关的 治疗基因基因治疗的两种形式体细胞基因治疗种系基因治疗 只限于某一体细胞的基因的改变 只限于某个体的当代 对缺陷的生殖细胞进行矫正 当代及子代2、基因治疗的方式 基因矫正或置换 基因增补 基因封闭 其他3、导入的方式 体外导入（ ex 外 将 基因 导入 细胞 内再将这种基因修饰过的细胞 回输 病人体内使这种带外源基因的细胞在体内 表达达到 治疗或预防 的目的 体内导入（ in 源基因 直接导入 体内有关的组织细胞使其 进入 相应的细胞并 表达基因治疗的基本程序治疗性基因的选择基因载体的选择 病毒载体非病毒载体靶细胞的选择 体细胞生殖细胞基因转移 间接体内疗法直接体内疗法外源基因表达的筛选 利用载体中的标记基因回输体内目前临床试验的治疗基因：合适的能达到治疗 /预防的目的基因的 目的基因的 人工合成基因片段 疗的基因的选择三、载体系统 病毒载体 非病毒载体 逆转录病毒载体 腺病毒 腺相关病毒 单纯胞疹病毒 哺乳动物人工染色体 脂质体 裸 基因缝合线法逆转录病毒载体逆转录病毒的生活周期进入宿主细胞 双链 为合成相应病毒蛋白质 的模板包装成 新的病毒颗粒 ，离开宿主逆转录病毒载体的构建长末端重复序列 包装信号 生病毒核心蛋白 产生逆转录酶 产生病毒外膜蛋白包装信号 目的基因 标记基因 体的特点基因重排低 外源基因于病毒 整合人的染色体 会导致恶性肿瘤宿主范围广 对受体细胞是否处于分裂期要求不严格使用效果好 外源基因在载体上容易高效表达3、腺相关病毒（ 于细小病毒科，其成熟病毒颗粒中有的含正链 的含负链 能独立繁殖，其繁殖依赖于辅助病毒（腺病毒或疱疹病毒）。 基因组仅 5两个 5和 3端各有一个由 145个氨基酸组成的反向重复序列（ 对病毒的复制、整合、包装等有重要调控作用。 优点：1)、反向末端重复序列中没有转录调控元件，减少激活原癌基因的可能性2）、宿主广，只能形成慢性感染3）、可发生位点特异性整合，有利于表达4）、热稳定性好，而作为辅助病毒的腺病毒在 60 即被灭活5）、安全性较好，本身不致病4、单纯疱疹病毒（ 链 因组大小 152缺失多个基因仍保持复制能力。 特点：1）、序列清楚2）、可容纳至少 30宿主广，可侵染脊椎动物各种细胞4）、重组病毒培养过程中易得到较高滴度5）、从外周进入神经系统，不影响神经元功能但表达产物对多种类型宿主有毒性，且可引起严重免疫反应，要进入临床仍需改进5、 痘病毒载体痘苗病毒为线形双链的有包膜病毒 , 其核心颗粒不依赖宿主细胞而独立引进转录和复制 ,宿主范围广泛，易于培养；痘苗病毒基因组中大量非必需基因的缺乏并不影响其在宿主细胞的复制能力 ,可允许在同一或不同非必需区插入多个基因痘苗病毒缺点是载体对细胞的毒性 ,同时病毒能被人体的补体系统灭活并降解表 常用病毒载体得特征和适用范围病毒载体 生物学特性 适用范围反转录病毒载体可感染分裂细胞；整合到染色体中表达时间长有致癌的危险Ex 疫原性弱；可长期表达外源基因在骨骼肌、心肌、肝脏、视网膜等组织中表达水平较高In 因治疗Ex 逆轴突传递可潜伏感染，容量大可感染分裂和非分裂细胞神经系统疾病的基因治疗肿瘤的基因治疗四、靶细胞1、造血细胞常用反转录病毒，体外基因转移，弥散的组织多，分散广。 对转入外源基因的细胞可检验，考虑安全性及有效性。 2、肌肉细胞常用。 肌肉细胞分布广，含量丰富，为 “ 永久性 ” 细胞，基因不会因分裂而丢失；细胞长而大，且为多核细胞，基因易转移和表达。 为 “ 非生命 ” 器官，安全；溶酶体少，外源因存活时间长；血流丰富，产物可释放入血3、皮肤表皮涂抹或肤内注射裸露 全、简便，易行，但皮肤不断更替。 4、其他如肝细胞、静脉注射等。 五、转移方法1、化学法磷酸钙微量沉淀外源 后与靶细胞混合。 染色体介导：用秋水仙素处理使染色体固缩，破碎，差速离心，分离出染色体，与受体细胞混合。 脂质体介导：临床已用受体介导：外源 受体结合进入细胞2、物理法直接注射法，显微注射法，电穿透法等3、病毒介导目前最常用和最成熟的方法六、基因治疗的临床试验当前基因治疗试验： 治疗性试验 基因标记 非治疗性试验治疗性试验 1、 遗传性疾病 2、恶性肿瘤 （ 1） 抑癌基因或细胞因子基因治疗 （ 2） 自杀基因系统 （ 3） 抑制血管生成 （ 4） 反义药物 （ 5）导入 （ 6）导入 因 3、病毒性感染 4、其他遗传疾病 缺失的基因产物 细胞类型严重联合免疫缺陷 腺苷酸脱氢酶 T/胞色素 b 中性粒细胞戈谢病 糖脑苷酶 巨噬细胞镰刀状细胞贫血 珠蛋白 红细胞和 地中海贫血 和 珠蛋白 红细胞黄嘌呤磷酸核糖转移酶 基底神经节缩素 肌肉细胞帕金森病 多巴胺 脑黑质肺气肿 1抗胰蛋白酶 肺上皮细胞囊性纤维化 /胰上皮细胞苯丙酮尿症 苯丙氨酸羟化酶 肝细胞家族性高胆固醇血症 低密度脂蛋白受体 肝细胞血友病 凝血因子 和 血小板、肝细胞遗传性单基因疾病 腺苷脱氨酶 (乏的严重联合免疫缺陷 (苷脱氨酶 (乏的严重联合免疫缺陷 (一个基因临床治疗的方案 ( 病因 : 淋巴细胞缺乏 治疗策略： 淋巴细胞 10%维持免疫系统功能改善病人症状治疗基本步骤 : 逆转录病毒载体 导入患者淋巴细胞 体外扩增 回输病人体内 淋巴细胞 % 维持免疫系统功能 ,改善病人症状恶性肿瘤的细胞因子基因治疗基因工程“瘤苗”策略 a：将刺激免疫反应的 细胞因子基因 (导肿瘤细胞， 提高肿瘤细胞的免疫原性转导细胞因子基因的肿瘤细胞 在体内持续分泌细胞因子增强抗肿瘤的免疫反应，形成 局部的抗肿瘤免疫微环境引发 全身的抗肿瘤免疫机能策略 b：引入抑瘤基因，如 世界上第一个获得批准临床使用的抗肿瘤基因药，由正常人肿瘤抑制基因 改构的 5型腺病毒基因重组而成。 通常判断一个抗癌基因必须同时具备以下条件：1、在该肿瘤中该基因发生了变化，包括突变、缺失、甲基化等。 2、将该基因的野生型导入肿瘤细胞能够部分或全部抑制其表型。 3、该基因在该肿瘤相应的正常组织中存在正常表达。 够与 8种以上细胞蛋白结合，生物学活性是引起细胞周期阻滞，诱导凋亡和细胞分化。 大约 50%的人类肿瘤中存在 2 in of 78is to be a of of NA to to of NA 自杀基因将一基因转入细胞，它编码的蛋白可将无毒的前药转变为有毒的物质如胸苷激酶基因（ 利用 992年经 10名接受治疗的患者，有 6名至今仍活着。 an 型胶原 84个氨基酸片段 , 具有抑制血管生成的作用。 重组鼠 以完全抑制小鼠肿瘤细胞的生长 ,并且不产生耐药性 ,经过几轮给药后小鼠的肿瘤被治愈。 结构与抑瘤效果。