电泳 Electrophoresis

电泳 Electrophoresis内容摘要：

电泳 Electrophoresis 电 泳(凌电泳技术的发明及发展11809年，俄国物理学家 贝尔奖金获得者 明了最早期的界面电泳，用于蛋白质分离的研究，开创了电泳技术的新纪元。 3近几十年以来，电泳技术发展很快，各种类型的电泳技术相继诞生，在生物化学、免疫学、医学等领域得到了广泛应用。 2电泳（ 念： 带电颗粒在电场作用下，向与其电荷相反的电极移动的现象。 3电泳的分类显微电泳 ：也称细胞电泳，是在显微镜下观察细胞或细菌的电泳行为自由界面电泳 ：在没有支持介质的溶液中进行的电泳区带电泳 ： 是指有支持介质的电泳，待分离物质在支持介质上分离成若干区带。 支持介质的作用主要是防止电泳过程中的对流和扩散。 是目前常用的电泳系统4纸电泳淀粉凝胶电泳醋酸纤维素薄膜电泳琼脂糖凝胶电泳 ：多用于 核酸 的分离聚丙烯酰胺凝胶电泳 ：可用于 核酸和蛋白质 的分离区带电泳按 支持介质种类 分类5聚丙烯酰胺凝胶电泳结果 琼脂糖凝胶电泳1 2 3 4 5 6 7 8 M 根据支持介质形状不同，可分为：薄层电泳板电泳柱电泳 据用途不同，可分为：分析电泳制备电泳定量电泳免疫电泳区带电泳的其他分类7本 章 内 容基本概念及原理聚丙烯酰胺凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦毛细管电泳印迹法（转移电泳）8第一节 基本概念及原理电泳是在电场作用下产生的物质运动。 电场力（ 阻力（ 电泳的基本原理若将带净电荷 受到的电场力为F = E·运动颗粒遵循 s 托克斯定律）6 = E·q = 6颗粒的移动速度 (泳动速度 v)与电场强度 (E)和颗粒所带电荷量 (q)成正比 ,而与颗粒的半径 (r)及溶液的粘度 ()成反比。 (1)(2)(3)E·4)颗粒的泳动速度与颗粒形状有关。 如非球形分子（如线状 电泳过程中受到更大的阻力。 10电泳的基本原理由（ 4）可知，带电颗粒的泳动速度受电场强度影响，使得同一种带电颗粒在不同电场里泳动速度不同，为了便于比较，常用泳动度（ m） 或 迁移率（ 代替泳动速度表示颗粒的泳动情况。 m = v/E = q/6 5）由上式可以看出， 迁移率仅与球形颗粒所带电荷数、颗粒大小及溶液粘度有关，与电场强度无关， 是带电颗粒的物理常数。 E·4）v =11电泳（ 场带电颗粒 溶 液支持物电泳的基本要素1213影响电泳的因素（一）颗粒的理化性质电荷、直径、形状（二）电场强度电场强度越大，带电颗粒的泳动速度越快；反之越慢常压电泳： 210V/高压电泳： 70200V/）溶液性质等电点越远，则带电量越大，泳动速度越快；反之越慢离子强度：一般在 低泳动速度过低：缓冲能力差溶液黏度：过大，泳动速度慢15影响电泳的因素是指在电场作用下 溶液 与其接触的固定的 支持介质 作相对运动的现象。 当支持介质 是非惰性物质 时，常常会因介质上存在的负离子基团吸附电极溶液中的正离子，使靠近介质的溶液层相对带电。 在电场的作用下，此溶液层会向负极移动。 （四）电渗（ 6电渗（ 7电渗18影响电泳的因素（五）焦耳热 电泳过程中释放出的热量与电流强度的平方成正比。 当电场强度或电极缓冲液以及样品中离子强度增高时，电流强度会增大。 将降低电泳的分辨率。 （六）筛孔 琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶：有大小不等的筛孔；筛孔越大，泳动速度越快。 19 是以 聚丙烯酰胺凝胶 为支持介质的电泳方法。 类型很多 单向、双向、梯度 分为连续系统与不连续系统两大类。 第二节 聚丙烯酰胺凝胶电泳（ 0聚丙烯酰胺凝胶电泳 （ 支持介质：聚丙烯酰胺凝胶单体： 丙烯酰胺单体 （ 双体，交联剂： N， N催化剂作用下聚合为凝胶 (三维网状结构 )21 C= C=,N丙烯酰胺 22 聚丙烯酰胺凝胶有下列 特性 ：(1) 在一定浓度时， 凝胶透明，有弹性，机械性能好；(2) 化学性能稳定；(3) 对 4) 几乎无吸附和电渗作用；(5) 样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达 10) 凝胶孔径可调节；(7) 分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体。 23聚丙烯酰胺凝胶电泳（ 不连续垂直柱状凝胶电泳 不连续垂直板状电泳 线性和阶梯式梯度的柱状及板状凝胶电泳 连续的盘状凝胶电泳和垂直板状电泳 半干式聚丙烯酰胺凝胶电泳 双向电泳24）聚丙烯酰胺凝胶合成1. 丙烯酰胺和双丙烯酰胺含量的确定2. 丙烯酰胺的聚合（二）分离效应25凝胶总浓度（ T）： 联度（ C）： ）：聚丙烯酰胺凝胶合成g） +g）V（ =g） +g）g）C=1、丙烯酰胺 (双丙烯酰胺 (量的确定凝胶孔径的大小由 决定26的关系 一般而言， 的增加而降低 %时，凝胶孔径最小。 因此目前有些实验室采用 a:b=19:1 a:胶呈糊状，易断裂。 27凝胶总浓度 (T)和交联度 (C)与孔径大小的关系 凝胶孔径大小主要受凝胶总浓度 (T)的影响。 凝胶浓度越大，孔径越小。 凝胶浓度过大，胶硬而脆，易折断。 浓度过小，凝胶稀软，不易操作，也易断裂。 当凝胶浓度确定后，交联度为 5%时，凝胶具有最小孔径， 超过 5%或低于 5%时凝胶孔径都要增大28凝胶浓度的选择 标准胶：在总浓度为 的凝胶中，大多数生物体内的蛋白质能得到满意的分离效果。 对于一个未知样品，常用 标准胶或 4%的凝胶梯度来测试，而后选出适宜的凝胶浓度。 0）聚丙烯酰胺凝胶合成1. 丙烯酰胺和双丙烯酰胺含量的确定2. 丙烯酰胺的聚合（二）分离效应312、丙烯酰胺的聚合 化学催化系统：是在 引发剂 和 加速剂 组成的系统中完成的。 有碱性系统和酸性系统 光催化系统原理（一）：聚丙烯酰胺凝胶合成32化学催化 碱性系统引发剂： 过硫酸铵（ 速剂： 四甲基乙二胺（ 二甲基丙腈、 二甲基丙腈亚硫酸盐微量 使过硫酸铵形成自由基： 2这些自由基的产生可引发丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺的聚合、交联反应，形成有一定平均孔径的聚丙烯酰胺凝胶。 33化学催化 酸性系统引发剂： 过硫酸铵 (氧化氢加速剂： 硫酸亚铁 4引发剂： 核黄素加速剂： 发聚合反应。 光聚合催化系统35丙烯酰胺聚合时常用的催化系统引发剂 加速剂 应用范围过硫酸铵（ ,N,N,N性系统3抗坏血酸 酸性系统核黄素 性系统（光聚合）36化学聚合与光聚合的比较化学聚合的凝胶孔径小，透明度好，重复性也较好，但 光聚合的凝胶对分析样品无任何不良影响，但凝胶呈乳白色，透明度较差37聚合影响因素大气氧能淬灭自由基，阻止多聚体链长的增加。 在进行化学聚合前， 在胶液表面，往往覆盖一层水或溶液，隔绝空气，可加速聚合。 低温会减慢聚合反应速度。 有些材料如聚丙烯酸甲酯有机玻璃，一些金属等可抑制聚合反应。 38）聚丙烯酰胺凝胶合成1. 丙烯酰胺和双丙烯酰胺含量的确定2. 丙烯酰胺的聚合（二）分离效应 浓缩效应、电荷效应、分子筛效应39原理（二）：分离效应聚丙烯酰胺凝胶电泳分为连续系统与不连续系统两大类。 其分离效应包括：1. 浓缩效应 (仅存在于不连续 2. 电荷效应3. 分子筛效应40不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳系统的不连续性表现在以下方面：两层凝胶组成上层为大孔径的浓缩胶下层为小孔径的分离胶。 层凝胶的 极缓冲液为 缩胶为 离胶为 缩效应（ 1）凝胶孔径不连续性：在电场作用下，颗粒在大孔胶中泳动遇到的阻力小，移动速度快；当进入小孔胶时，颗粒泳动受到的阻力大，移动速度减慢。 因而在 两层凝胶交界处 ，由于凝胶孔径的不连续性使样品迁移受阻而压缩成 在浓缩胶中 电场中迁移率快，称为前导离子或快离子。 甘氨酸在 电场中迁移率很慢，称为尾随离子或慢离子。 酸性蛋白在浓缩胶中解离后带负电荷（。 泳动度比较：（ 2）缓冲体系离子成分及 泳开始时，在电流的作用下，浓缩胶中 快泳动到最前面，蛋白质紧随于其后，而甘氨酸在最后面。 电泳初期，快离子向前移动，而在快离子原来停留的那部分区域则形成了低离子浓度区，即低电导区。 44 低电导区有较高的电场强度，使蛋白质离子与慢离子在此区域加速前进。 在快、慢离子间的蛋白质样品 就在这个追赶过程中被逐渐地 压缩聚集 成一条狭窄的区带。 452、电荷效应 当样品进入分离胶后 ，由于每种蛋白质所带的电荷多少不同，因而迁移率也不同。 电荷多的，分子小的泳动速度快，反之，则慢。 于是，各种蛋白质在凝胶中得以分离。 463、分子筛效应 分子量或分子大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径分离胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率，此即 分子筛效应。 颗粒小，形状为圆球。