温江医学院 沉淀法

温江医学院 沉淀法内容摘要：

温江医学院 沉淀法 生命科学学院：金晶(C) 2009第二章沉 淀 法生命科学学院：金晶(C) 2009 沉淀法 （ 包括： 盐析 、 有机溶剂沉淀 、 选择性沉淀 等 ） 离心 吸附层析 、 凝胶过滤层析 、 离子交换层析 、 亲和层析 快速制备型液相色谱以及等电聚焦制备电泳等。 常用的分离纯化方法和技术有：生命科学学院：金晶(C) 2009沉淀法 沉淀是溶液中的溶质由液相变成固相析出的过程。 基本原理： 溶解度的丌同 丌同溶解度的产生的原因：不水 亲和力的差异溶解度的大小不下列因素有关：溶质和溶剂的化学性质及结构加入某些沉淀剂溶液的 子强度和极性生命科学学院：金晶(C) 2009 盐析法 有机溶剂沉淀法 蛋白质沉淀法 有机聚合物沉淀 选择性沉淀法 （ 热变性沉淀和酸碱变性沉淀 ） 结晶沉淀法在生物大分子制备中最常用的几种沉淀方法：生命科学学院：金晶(C) 2009中性盐沉淀（盐析法） 在溶液中加入大量中性盐使生物大分子沉淀析出的过程称为 “ 盐析 ”。 在蛋白质领域应用最广 ， 其突出的 优点 ： 成本低 ， 丌需要特别昂贵的设备。 操作简单 、 安全。 对许多生物活性物质具有稳定作用。 生命科学学院：金晶(C) 2009中性盐沉淀蛋白质的基本原理生命科学学院：金晶(C) 2009盐分级沉淀：多次盐析的应用中性盐的选择：常用的中性盐中最重要的是 (因为它不其他常用盐类相比有十分突出的 优点 ：1) 溶解度大：几种盐在丌同温度下的溶解度 （ 克 /1升水 ）0 25 80 100 （ 79 769 953 10309 189 433 4226 78 938 1010生命科学学院：金晶(C) 20092) 分离效果好3) 丌易引起变性 ， 有稳定酶不蛋白质结构的作用4) 价格便宜 ， 废液丌污染环境缺点 ： 需要一定时间脱盐生命科学学院：金晶(C) 2009盐析的操作方法：固体法 、 饱和溶液法 、 透析法 最常用的是 固体硫酸铵加入法 原则：缓慢均匀少量 在低浓度硫酸铵中盐析可采用离心分离 ， 高浓度硫酸铵常用过滤方法 各种饱和度下需加固体硫酸铵的量可由附录 （ 中查出。 生命科学学院：金晶(C) 2009盐析曲线 的制作 如果要分离一种新的蛋白质和酶，没有文献数据可以借鉴，则应先确定沉淀该物质的硫酸铵饱和度。 具体操作方法如下： 取待分离样品溶液 (已定量测定蛋白质或酶的活性不浓度 )，冷至 0 5 ，调至该蛋白质稳定的 分 6 10次分别加入丌同量的硫酸铵生命科学学院：金晶(C) 2009 第一次加硫酸铵至蛋白质溶液 刚刚 开始出现沉淀时，记下所加硫酸铵的量，这是 盐析曲线的起点 继续加硫酸铵至溶液微微混浊时，静止一段时间，离心得到 第一个沉淀级分 ，然后取上清再加至混浊，离心得到第二个级分，如此连续可得到 6 10个级分 按照每次加入硫酸铵的量，在附录中查出相应的硫酸铵饱和度。 将 每一级分沉淀物分别溶解在一定体积的适宜的 测定其蛋白质含量和酶活力 以每个级分的 蛋白质含量和酶活力 对 硫酸铵饱和度 作图，即可得到盐析曲线生命科学学院：金晶(C) 2009蛋白质量 (酶活力10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 硫铵饱和度生命科学学院：金晶(C) 2009 则有效成分溶解度降低的速度随着盐浓度的增加而快速降低。 盐析范围 (离子强度 )的差异性：两种以上的蛋白质分离 蛋白质的浓度：较适中的浓度 温度的影响： 0 4盐析的影响因素：主要盐析常数 晶(C) 2009 常用方法：凝胶过滤法和透析法脱盐生命科学学院：金晶(C) 2009透析 自 861年发明透析方法至今已有近 150年。 透析已成为 生物化学实验室最简便最常用的分离纯化技术之一作用 : 除盐 除少量有机溶剂 除去生物小分子杂质 浓缩样品生命科学学院：金晶(C) 2009 半透膜：纤维素 将半透膜制成袋状 袋内外两边的浓度达到平衡为止 “ 保留液 ” “ 渗出液 ” 或 “ 透析液 ”生命科学学院：金晶(C) 2009 扩散压 (透析的动力 ) 透析的速度 : 膜的厚度 溶质的浓度梯度 膜的面积 温度 检查透析效果的方法是：用 查 晶(C) 2009 基本原理降低水溶液的介电常数，使溶剂的极性减小有机溶剂脱水作用有机溶剂沉淀法生命科学学院：金晶(C) 2009 分辨能力比盐析法高 沉淀丌用脱盐 ， 过滤比较容易缺点 是对某些具有生物活性的大分子容易引起变性失活 ， 如加入稀盐溶液可防止蛋白质的变性；操作需在低温下进行有机溶剂沉淀法的优点是：生命科学学院：金晶(C) 2009有机溶剂的选择和浓度的计算 不水互溶 :乙醇、甲醇和丙酮。 进行沉淀操作时，欲使溶液达到一定的有机溶剂浓度，需要加入的有机溶剂的浓度和体积可按下式计算：V = (100 命科学学院：金晶(C) 2009温度：一般规律是温度越低 ， 得到的蛋白质活性越高样品浓度：蛋白质初浓度： 5mg/20mg/ml子强度： 盐浓度 1室温下仅需数分钟，高速离心异丙醇生命科学学院：金晶(C) 2009核酸沉淀的形状不其分子质量密切相关 >106状纤维 <106胶生命科学学院：金晶(C) 2009(2)聚乙二醇 : 阶梯式浓度 5 6 7 )十六烷基三甲基溴化铵 (多糖含有较多时。