年产3万吨红曲色素生产工艺设计＿毕业设计(编辑修改稿)

年产3万吨红曲色素生产工艺设计＿毕业设计(编辑修改稿)内容摘要：

一些工作 ， 但研究进展缓慢。 近 10多年来 ,随着微生物学的发展 ， 中外的专家学 者对红曲色素进行了大量广泛而深入的研究 ， 在红曲色素分离、结构鉴定及改性、生成机制、菌种改良、液态发酵工艺优化、代谢产物基因调控、功能性及安全性等理论和应用方面的研究都卓有成效 ， 不断拓展着红曲色素的应用领域 [17]。 20世纪 90年代以来国内外在红曲色素的液态发酵生产方面做了大量工作 ， 研究已取得突破性进展。 液态发酵生产的红曲色素 ,主要成分是水溶性的“复合色素”。 采用这种生产方式具有周期短、产量高、杂质少、产品质量稳定等优点 ， 有助于实现生产自动化 ， 提高产品质量稳定性 ,扩大生产规模。 液态发酵法生产的红曲色素色价 偏低 ， 这是制约其工业化生产的重要原因之一 ， 为此 ， 国内外广泛开展了液态发酵菌种改良和工艺条件优化的研究。 目前 ， 提高红曲色素色价的途径主要有 : 提高红曲菌的生物量、添加促进色素形成的物质等 ， 具体措施有 ： 菌种诱变、固定化细胞技术 、 葡萄糖流加培养、菌种联合培养、添加抗氧化剂和金属离子、添加植物油、青霉素以及使用超声波处理等。 另外 ， 红曲色素发酵生产中使用的原料多以大米或饴糖、葡萄糖、淀粉、大豆蛋白粉等为主 ， 导致粮食消耗量大或生产的综合成本较高 ， 目前国内外已开发利用马铃薯、玉米、小米等为主要原料进行生产的研究 [18]。 Silvana等 [19]以葡萄皮籽为原料 ， 研究确定了液态发酵生产红曲色素的工艺条件。 由此可见 ， 以农业工业废弃物为原料生产红曲色素有很中北大学 20xx 届毕业设计说明书 第 4 页 共 25 页 大的潜力 ， 这将是红曲色素生产的发展方向之一。 本课题的意义 红曲色素是红曲在菌体生长代谢过程中产生的天然色素 ， 与其它天然色素相比 ， 具有热稳定性好 ， 蛋白着色力强 ， 色调柔和 ， 对酸碱稳定 ， 还可以提高加工制品对光和氧稳定等优点。 而且红曲色素无毒性、无致突变作用 ， 安全性很高。 另外 ， 研究发现红曲色素是多种色素成分的混合物 ， 从红色红曲霉产生的色素中还可分离提纯出两种新的红曲色素。 因此 红曲可提供性能稳定、安全性高、品种多样的天然色素。 红曲色素符合食品着色剂“天然、营养、多功能”的发展方向 ， 具有很好的应用前景。 中北大学 20xx 届毕业设计说明书 第 5 页 共 25 页 2 红曲霉菌种的选育 红曲色素 生产菌 本设计以从土壤中筛选得到的红曲霉菌株为出发菌株，经紫外线和超声波复合诱变，筛选得到了得到高产红曲色素的菌株。 菌种描述 红曲霉 在 麦芽 汁琼脂培养基上生长良好，菌落初为白色，老熟后变成 淡粉色、紫色或灰黑色。 红曲霉 菌丝体 的 大量分枝的顶端产生单个或成串的 分生孢子 ， 孢子 呈球形或椭圆形 ， 闭囊壳橙红色，近球形，含有多数子囊， 子囊 内含 8个孢子， 子囊孢子 卵形或近球形，光滑，透明，无色或漆红色。 红曲霉能在 15~45℃ 生长 ，最适 生长 温度为 32~35℃ ，最适 生长 pH为 ~，有良好的耐酸和耐乙醇能力。 能利用淀粉、糊精、麦芽糖、蜜二糖、纤维二糖、葡萄糖、甘油、乙醇、乳酸、苹果酸、柠檬酸等多种糖类和酸类作为碳源，能利用硝基氮、氨基氮和有机氮。 红曲霉能自身合成生物素、硫胺素、核黄素、麦角固醇等多种维生素。 红曲霉可代谢生成多种酶类，有葡萄糖淀粉酶、葡萄糖苷酶、蛋白水解酶、酯化酶等。 色价分析方法 液态发酵样品用滤纸过滤得滤液和滤渣，滤液经适当稀释后用 721型分光光度计于510 nm处测定 OD值，滤渣用蒸馏水洗涤 3次后于 60℃ 烘干称重测得生物量，然后称取 1g干菌丝用 75%的乙醇浸提 2次，每次 2h，过滤，合并后的滤液适当稀释后用 721型分光光度计于 510 nm处测定 OD值。 色价 =稀释倍数 OD值。 诱变选育 选育过程： 复合诱变流程：出发菌株→超声波诱变→平板分离→紫外诱变→平板分离→稳定性试验→对比试验 孢子悬浮液的制备： 菌株在 33℃ 斜面培养 4d后，用无菌生理盐水洗下红曲霉孢子，倒入 已灭菌的装有 20~30颗玻璃珠的三角瓶中，放入摇床中 220r/min 振荡 1h，孢子分散均匀即可。 用 4层无菌镜头纸过滤除去菌丝，制成孢子悬浮液，浓度稀释至 l06个 /mL，以备用。 中北大学 20xx 届毕业设计说明书 第 6 页 共 25 页 复合诱变 （ 1） 超声波诱变： 将 9支装有菌悬液的试管放入超声波清洗仪的工作箱内，调整超声波功率为 500w ，分别作用 5min~45min后，取出试管即刻放到冰水中冷却，防止超声波产热杀死孢子。 将所得孢子悬液稀释 l06倍涂布， 32℃的培养箱中培养 3d后观测、计数，对诱变后的菌株进行筛选。 （ 2） 紫外诱变：将经 超声波 诱变筛选好 的菌株进行孢子悬浮液的配制，取浓度为 106个 /mL红曲霉孢子悬浮液 5mL，加入直径 90mm的无菌培养皿中，先预热紫外灯 30min，然后开启平皿盖于磁力搅拌下分别处理 1min、 、 2min、 、 3min、 4min（ 15W， 30cm），然后稀释至 l05倍，分别吸取 3个稀释度的孢子悬浮液各，培养 3d~4d后，计算致死率（紫外诱变致死的孢子数与未经诱变总孢子数的比值）和正突变率（菌落直径与扩散圈直径比值比未经诱变的菌落直径与扩散圈直径比值小的为正突变的 菌落，正突变的菌株与总菌株个数的比值称正突变）。 以致死率70%~80%、正突变率最高为最适突变剂量，以最佳剂量处理孢子悬浮液，涂布平板，挑去单菌落进行摇瓶筛选 [23]。 摇瓶筛选 （ 1）小瓶发酵初筛：斜面培养 5d~7d，待孢子成熟，接种于装有 20mL发酵培养基的 250mL三角瓶中， 220r/min、 32℃培养 96 h。 重复接种 3瓶。 根据生物量高的 5~8株用于复筛和菌种保藏。 （ 2）大瓶复发酵复筛：用初筛出的 5~8株菌的成熟斜面孢子接种于装有 80mL种子培养基的 500mL三角瓶中， 220r/min， 32℃培养 48h，得种子液。 取种子液 8mL~10mL接种于装有 80mL~100mL 发酵培养基的 500mL三角瓶中， 220r/min、 32℃培养 96h。 根据提 取红曲色素 产量高筛选出 1~2株用于下一轮诱变处理 [22]。 稳定性试验 将诱变后的菌株传代 10次，每代都进行摇瓶发酵试验，产量稳定的则其性能可能稳定。 菌种保藏 其原理是根据菌种的生理生化特点，人工创造条件，使孢子和菌体的生长代谢活动尽量降低，以减少其变异。 菌种保藏的方法有：斜面冰箱保藏法、 砂 土管保藏法、菌丝速冻法 、石蜡油封存法、中北大学 20xx 届毕业设计说明书 第 7 页 共 25 页 真空冷冻干燥保藏法、液氮超低温保藏法。 对于 红曲霉 采用斜面冰箱保藏法。 3 培养基 红曲霉 的培养基 A：斜面培养基：可溶性淀粉 3%，葡萄糖 6%，蛋白胨 2%，琼脂 3%，自来水，乳酸调节 pH值至 ， 121℃ 高压灭菌 30 min。 B： 种子培养基：早籼稻米粉 3%， NaNO3 %， KH2P04 %， MgS04 %，自来水，乳酸调节 pH值至 ~， 121℃ 高压灭菌 30 min。 C： 基本发酵培养基 ： 大米粉 9%， 葡萄糖 7%， 蛋白胨 2%， NaNO3 %， KH2P04 %，MgS04 %， pH ~， 121℃ 高压灭菌 30 min。 D： 补料培养基： 补料 1： 25%~28%氨水，使 pH保持在设定范围内。 补料 2： 80%磷酸，使 pH保持在设定范围内。 补料 3：葡萄糖 20%，蛋白胨 2%， NaNO3 %， KH2P04 %， MgS04 %， pH ~。 培养基的设计 碳源 碳源是发酵培养基中最重要的组分之一，是微生物代谢的能量来源。 葡萄糖作为发酵培养基中的碳源时，最终所得的红曲色素色阶高于蔗糖、麦芽糖和 大米粉为碳源下的。 但是因为大米粉市场价格明显低于葡萄糖价格，两者差距不大，因此，宜选用大米粉作为红曲霉发酵培养基中的碳源。 在红曲霉产红曲色素的发酵过程中，由于碳源的补加促进了菌体的生长，从而促进了红曲色素色阶的提高。 值得注意的是，尽管补加蔗糖所得的菌体量显著高于补加葡萄糖方案条件下的菌体量，但是其红曲色素色阶却显著低于补加葡萄糖的方案。 虽然补加麦芽糖得到的红曲色素色阶高于补加葡萄糖的方案，但是二者之问无差异显著性。 综合原料成本，宜选用葡萄糖作为红曲霉最佳的补加碳源。 氮源 氮源是构成细胞中所含 蛋白质、核酸、酶等成分，以及代谢产物中氮素来源的营养物质，所有红曲霉在生长时均可利用无机氮源。 工业生产中通常使用的氮源有氨、铵盐中北大学 20xx 届毕业设计说明书 第 8 页 共 25 页 和尿素。 当培养基中碳源不足时，可作为补充碳源。 常用的氮源有有机氮源和无机氮源两大类。 黄豆饼粉、花生饼粉、棉籽饼粉、玉米浆、蛋白胨、酵母粉、鱼粉、菌丝体和酒糟等都是有机氮源。 无机氮源有氨水、硫酸铵、氯化铵、硝酸盐等。 氮是构成微生物细胞蛋白质和核酸的主要元素，因此是菌体生长以及代谢产物形成所必需的。 为探索出红曲霉发酵培养基中的最佳氮源，选用蛋白胨作为氮源，其对应的红曲色素色阶显著高于 其它氮源下所得的红曲色素色阶。 但蛋白胨市场价格高于硝酸钠等氮源物质，用硝酸钠替代后结果差异不是很大， 因此选用硝酸钠作为红曲霉发酵的氮源。 无机盐及微量元素 无机盐类是微生物必不可少的一类物质，它们为微生物的正常代谢提供多种重要的生理功能。 硫酸镁、磷酸二氢钾、硫酸锌、硫酸锰等无机盐类对红曲霉发酵产红曲色素的测定结果，当发酵培养基中添加磷酸二氢钾，硫酸镁时所得的红曲色素色阶显著高于不添加任何无机盐类的试验方案。 因此，磷酸二氢钾，硫酸镁对红曲色素的合成具有显著的促进作用。 中北大学 20xx 届毕业设计说明书 第 9 页 共 25 页 4 灭菌 所 谓灭菌，是指用物理或化学方法杀灭或去除物料或设备中一切有生命物质的过程。 应用的范围有： （ 1） 培养基灭菌； （ 2） 气体灭菌； （ 3） 设备及管道灭菌等。 常用的灭菌方法有以下几种： a、化学灭菌； b、射线灭菌； c、干热灭菌； d、湿热灭菌； e、过滤灭菌。 化学灭菌：由于化学药剂会与培养基中的一些成分作用，而且加入培养基后不易去除，所以化学灭菌不用于培养基的灭菌。 但染菌后的培养基可以用化学药剂处理。 射线灭菌：紫外线的穿透力低，所以仅用于表面消毒和空气的消毒。 湿热灭菌： 灭菌原理是直接用蒸汽灭菌，蒸汽在冷凝时能释放出大量 潜热 ， 蒸汽具有强大的穿透力，破坏菌体蛋白和核酸的化学键，使酶失活，微生物因代谢障碍而死亡。 水煮常压灭菌： 100℃。 或饱和蒸汽灭菌：一般 121℃ ， 30 分钟。 适合培养基和发酵设备灭菌。 干热灭菌： 灭菌原理是利用高温对微生物有氧化、蛋白质变性和电解质浓缩作用而杀灭微生物。 常用灼烧和电热箱加热， 140~180℃、 1~2小时。 适于对玻璃及金属用具及沙土管灭菌。 过滤除菌： 除菌原理是利用微生物不能透过滤膜除菌。 方法是使用 ~ mm孔径滤膜，用于压缩空气、酶溶液及其他不耐热化合物溶液除菌。 仪器灭菌 在发酵操作过程中，种子活化、扩大培养需要接种环、摇瓶、试管等仪器。 接种环应用火焰灼烧法灭菌；摇瓶、试管应用蒸煮法灭菌。 经过灭菌 的 仪器不要暴露于空气中或于其它的未知仪器接触，并及时使用，以免再次带菌。 培养基灭菌 对于培养基灭菌大多采用湿热灭菌，即利用饱和水蒸气有很强的穿透力，而且在冷凝时放出大量冷凝热，很容易使蛋白质凝固而杀灭各种微生物。 同时蒸汽 的价格低廉，来源方便，灭菌效果可靠，所以培养基灭菌，发酵设备及管道的灭菌，试验用材料的灭菌，普遍采用这种灭菌方法。 通常的蒸汽灭菌条件是在 121℃ （表压约 ）维持 30min。 分批灭菌 是将先配制好的培养基放在发酵罐或其他容器中，通入蒸汽将培养基和所用设备一中北大学 20xx 届毕业设计说明书 第 10 页 共 25 页 起灭菌的操作过程（适用于小型发酵罐）。 连续灭菌 连续灭菌也叫连消，就是将将配制好的并经预热的 培养基 用泵连续输入由直接蒸汽加热的加热塔，使其在短时间内达到灭菌温度（ 126~132℃ ）。 然后进入维持罐（或维持管），使在灭菌温度下维持 5~7 分钟后再进入冷却管，使其冷却至接种温度 并直接进入已事先灭菌（空罐灭菌）过的 发酵罐 内。 其过程均包括加热、维持和冷却等灭菌操作过程。 连续灭菌的 连续性强，快速。