年产1200吨青霉素钠盐发酵车间工艺初步设计毕业设计(编辑修改稿)

年产1200吨青霉素钠盐发酵车间工艺初步设计毕业设计(编辑修改稿)内容摘要：

产量从 90 年代的初的约占世界总产量的三分之一逐步增加到目前的 90%以上。 中国青霉素行业发展迅速。 目前中国青霉素工业盐产能已达 10 万吨 /年，而每年全球需求量也只有 5— 6 万吨，将青霉素作为制备其他抗生素母核的原 料，让绝大部分抗生素品种摆脱了依赖进口的局面。 面对国际市场对青霉素产品的需求的减弱和国内市场抗生素产品的升级，可知我国的青霉素需求量还是呈上升趋势。 青霉素分子结构及分类 青霉素是 6－氨基青霉烷酸（ 6aminopenicillanic acid， 6APA）苯乙酰衍生物。 侧链基团不同，形成不同的青霉素，主要是青霉素 G。 工业上应用的有 钾 、 钠 、普鲁卡因、二苄基乙二胺盐 ，其在水中溶解度很小，且很快失去活性。 青霉素的分子通式为： RC9O4H11 N2 S 第一章 绪论 3 结构通式可表示为下图： 图 11 青霉素结构通 式 然而青霉素发酵液中含有 5 种以上天然青霉素（如青霉素 F、 G、 X、 K、 F 和 V 等），它们的差别仅在于侧链 R 基团的结构不同，其中青霉素 G 在医疗中用得最多，它的 钾 或 钠 盐为治疗革兰氏阳性菌的首选药物，对革兰氏阴性菌也有强大的抑制作用。 青霉素的单位 目前国际上青霉素活性单位表示方法有两种：一是指定单位（ unit）；二是活性质量（ μg），最早为青霉素规定的指定单位是： 50mL 肉汤培养基中恰能抑制标准金葡萄菌生长的青霉素量为一个青霉素单位。 在以后，证明了一个青霉素单位相当于 青霉素钠。 因此青霉素的质量单 位为 : 青霉素钠等于 1 个青霉素单位。 由此， 1mg 青霉素钠等于 1667 个青霉素单位 (unit)。 作用机理 有研究认为，青霉素的抗菌作用与抑制细胞壁的合成有关 [1]。 细菌的细胞壁是一层坚韧的厚膜，主要由多糖组成，也含有蛋白质和脂质，用以抵抗外界的压力，维持细胞的形状。 细胞壁的里面是细胞膜，膜内裹着细胞质 ， 青霉素作用于 β内酰胺类细菌的细胞壁。 革兰氏阳性菌细胞壁的组成是肽聚糖占细胞壁干重的 50％～ 80％（革兰氏阴性菌为 1％～ 10％）、磷壁酸质、多糖 、 脂蛋白和蛋白质。 其中肽聚糖是一种含有乙酰基 葡萄糖胺和短肽单元的网状生物大分子，在它的生物合成中需要一种关键的酶即转肽酶。 青霉素作用的部位就是这个转肽酶。 现已证明青霉素内酞胺环上的高反应性肽键受到转肽酶活性部位上丝氨酸残基的羟基的亲核进攻形成了共价键，生成青霉噻唑酰基 酶复合物，从而不可逆的抑制了该酶的催化活性。 通过抑制转肽酶，青霉四川理工学院毕业设计 4 素使细胞壁的合成受到抑制，细菌的抗渗透压能力降低，引起菌体变形，破裂而死亡。 即 作用 机理 是干扰细菌细胞壁的合成。 因为 青霉素的结构与细胞壁的成分粘肽结构中的 D丙氨酰 D丙氨酸近似，可与后者竞争转 肽酶 ，阻碍 粘肽 的形成，通过抑制细菌细胞壁四肽侧链和五肽交连桥的结合而阻碍细胞壁合成而发挥杀菌作用。 造成细胞壁的缺损，使细菌失去细胞壁的渗透屏障，对细菌起到杀灭作用。 对革兰阳性球菌及革兰阳性杆菌、 螺旋体 、 梭状芽孢杆菌 、 放线菌 以及部分 拟杆菌 有抗菌作用。 对 溶血性链球菌 等 链球菌属 ， 肺炎链球菌 和不产 青霉素酶 的葡萄球菌具有良好抗菌作用。 对肠球菌有中等度抗菌作用。 对 流感嗜血杆菌 和百日咳鲍特氏菌亦具一定抗菌活性 ， 对梭状芽孢杆菌属、消化链球菌、 厌氧菌 以及产黑色素拟杆菌等具良好抗菌作用。 青霉素的应用 临床应用： 40 多年 来 ，主要控制敏感金黄色葡糖球菌、链球菌、肺炎双球菌、淋球菌、脑膜炎双球菌、螺旋体等引起感染，对大多数革兰氏阳性菌（如金黄色葡萄球菌）和某些革兰氏阴性细菌及螺旋体有抗菌作用。 优点：毒性小，但由于难以分离除去青霉噻唑酸蛋白（微量可能引起过敏反应），需要皮试。 产品药理 青霉素 为β内酰胺抗生素对革兰阳性菌及某些革兰阴性菌有较强的抗菌作用，金黄色葡萄球菌 (金葡菌 )、肺炎球菌、淋球菌及链球菌等对本品高度敏感；脑膜炎双球菌、破伤风杆菌 、 白喉杆菌及梅毒螺旋体也很敏感。 主要用于敏 感菌引起的各种急性感染，如肺炎、支气管炎、脑膜炎、腹膜炎、心内膜炎、脓肿、败血症、蜂窝组织炎、乳腺炎、淋病、回归热、钩体病、梅毒、白喉及中耳炎等。 对溶血性链球菌等链球菌属，肺炎链球菌和不产青霉素酶的葡萄球菌具有良好抗菌作用。 对肠球菌有中等度抗菌作用，淋病奈瑟菌、脑膜炎奈瑟菌、白喉棒状杆菌、炭疽芽孢杆菌、牛型放线菌、念珠状链杆菌、李斯特菌、钩端螺旋体和梅毒螺旋体对本品敏感。 本品对梭状芽孢杆菌属、消化链球菌厌氧菌以及产黑色素拟杆菌等具良好抗菌作用，通过抑制细菌细胞壁合成而发挥杀菌作用。 第二章 工艺设计 5 第二章 工艺设计 青霉素的生 产原料 菌种 常用菌种为产黄青霉（ Pen chrysogenum ）。 当前生产能力可达 50000— 90000μ /ml。 按其在深层培养中菌丝的形态，可分为球状菌和丝状菌。 今常用绿色丝状菌为代表。 培养基 培养基成分为： ⑴ 碳源 青霉菌能利用多种碳源和乳糖、蔗糖、葡萄糖等。 目前普遍采用淀粉经淀粉酶水解的葡萄糖糖化液（ DE值 50%以上）进行流加。 ⑵ 氮源 选用玉米浆、玉米饼粉等并补加无机氮源。 ⑶ 前体 微生物合成含有苄基基团的青霉素 G，需在发酵中加入前体如苯乙酸或苯乙酰胺。 一次加入量不能大于 %，并采用多次加入方式。 ⑷ 无机盐 包括硫、磷、钙、镁、钾等盐类。 铁离子对青霉菌有毒害作用，应严格控制发酵液中铁离子的含量在 30 μ /ml以下。 青霉素发酵过程 青霉素发酵过程中的代谢变化分为菌体生长、青霉素合成和菌体自溶三个阶段 [2] 菌体生长阶段 发酵培养基接种后生产菌在合适的环境中经过短时间的适应，即开始发育、生长和繁殖，直至达到菌体的临界浓度。 这个阶段主要是碳源（包括糖类、脂肪等）和氮源的分解代谢，以及菌体细胞物质的合成代谢变化，前者的代谢途径和后者有机地联系在 一起，碳源、氮源和磷酸盐等营养物质不断被消耗，新菌体不断合成。 随着菌体四川理工学院毕业设计 6 浓度的不断增加，摄氧率不断增大，溶解氧水平不断降低。 当达到菌的临界浓度时，摄氧率达到最大，溶解氧降至最小。 当营养物质的消耗达到一定程度，菌体生长达到一定浓度，或者溶解氧的供应下降到某一水平，即成为限制因素时，菌体生长速度减慢；同时，由于菌体的某些中间代谢产物的迅速积累、原有的酶活力下降以及出现与抗生素合成有关的新酶等原因，导致生理阶段的转变，发酵就从菌体生长阶段转入青霉素合成阶段。 青霉素合成阶段 这个阶段主要合成青霉素，青霉素的生产速 率达到最大，并一直维持到青霉素合成能力衰退。 在这个阶段，菌体重量有所增加，但产生菌的呼吸强度一般无显著变化。 这期间以碳源和氮源的分解代谢和青霉素的合成代谢为主，前者的代谢途径和后者有机地联系在一起，碳源、氮源等营养物质不断消耗，青霉素不断合成。 此外，由于存在着抗生素合成和菌体合成二条不同的代谢途径，需要严格控制发酵条件，以利抗生素合成代谢的进行。 一般在这个阶段，发酵液中碳源、氮源和磷酸盐等营养物质的浓度必须控制在一定范围内，才有利于青霉素合成；如果这些物质过多，则只会促进菌体生长，抑制青霉素合成；如果这些物 质过少，则菌体容易衰老，青霉合成能力也会衰退，对生产不利。 除此之外，发酵液的 pH 值、温度和溶解氧浓度等都会影响发酵过程中的代谢变化，进而影响青霉素产量，必须予以严格控制。 此阶段一般又称为青霉素分泌期或发酵中期。 菌体自溶阶段 这个阶段菌体衰老，细胞开始自溶，合成青霉素能力衰退，青霉素生产速率下降，氨基氮增加， pH 上升。 此时发酵必须结束，否则不仅会使青霉素受到破坏，还会给发酵液过滤和提炼带来困难。 此阶段一般又称为菌体自溶期或发酵后期。 生产 工艺 青霉素的生产方法有产 天然青霉素 法和青霉素 半 合成 法。 天然青霉素的生产方法 天然 青霉素 G 生产可分为菌种发酵和提取精制两个步骤。 ① 菌种发酵：将产黄青霉菌接种到固体培养基上，在 25 ℃ 下培养 7～ 10 天，即可得青霉菌孢子培养物。 用无菌水将孢子制成悬浮液接种到种子罐内已灭菌的培养基中，通入无菌空气、搅拌，第二章 工艺设计 7 在 27 ℃ 下培养 24～ 28h，然后将种子培养液接种到发酵罐已灭菌的含有 苯乙酸 前体的培养基中，通入无菌空气，搅拌，在 27 ℃ 下培 养 7 天。 在发酵过程中需补入苯乙酸前体及适量的培养基。 ② 提取精制：将青霉素发酵液冷却，过滤。 滤液在 pH2～ 的条件下，于萃取机内用醋酸丁酯进行多级逆流萃取，得到丁酯萃取液，转入 ～ 的缓冲液中，然后再转入丁酯中，将此丁酯萃取液经活性炭脱色，加入成盐剂，经共沸蒸馏即可得青霉素 G 钾盐。 青霉素 G钠盐是将青霉素 G钾盐通过离子交换树脂（钠型）而制得。 半合成青霉素的生产方法 以 6APA 为中间体与多种化学合成有机酸进行酰化反应，可制得各种类型的半合成青霉素。 6APA 是利用微生物产生的青霉素酰化酶裂解青 霉素 G 或 V而得到。 酶反应一般在40～ 50 ℃、 pH8～ 10 的条件下进行；近年来，酶固相化技术已应用于 6APA 生产，简化了裂解工艺过程。 6APA 也可从青霉素 G 用化学法来裂解制得，但成本较高。 侧链的引入系将相应的有机酸先用氯化剂制成酰氯，然后根据酰氯的稳定性在水或有机溶剂中，以无机或有机碱为缩合剂，与 6APA 进行酰化反应。 缩合反应也可以在裂解液中直接进行而不需分离出 6APA。 因产天然青霉素法生产工艺较半合成青霉素法简单，而且采用发酵罐培养，每批次生产效率高，而半合成法对工艺要求较高，且中间物质较多，可能存在 生产中中间体转化不完等因素，而且成本较高，所以本设计采用天然青霉素的生产方法。 常见发酵方式 根据操作方式的不同，发酵过程主要有分批发酵、连续发酵和补料分批发酵三种类型。 四川理工学院毕业设计 8 分批发酵 营养物和菌种一次加人进行培养，直到结束放出，中间除了空气进人和尾气排出，与外部没有物料交换。 传统的生物产品发酵多用此过程，它除了控制温度和 pH 及通气以外，不进行任何其他控制，操作简单。 但从细胞所处的环境来看，则明显改变，发酵初期营养物过多可能抑制微生物的生长，而发酵的中后期可能又因为营养物减少而降低培养效率，从 细胞的增殖来说，初期细胞浓度低，增长慢，后期细胞浓度虽高，但营养物浓度过低也长不快，总的生产能力不是很高。 其优点是：①对温度的要求低，工艺操作简单；②比较容易解决杂菌污染和菌种退化等问题；③对营养物的利用效率较高，产物浓度也比 连续发酵 要高。 缺点是：①人力、物力、动力消耗较大；②生产周期较短，由于分批发酵时菌体有一定的生长规律，都 要经历延滞期、对数生长期、稳定期和衰亡期，而且每批发酵都要经菌种扩大发酵、设备冲洗、灭菌等阶段； ③生产效率低，生产上常以体积生产率（以每小时每升发酵物中代谢产物的 g 数来表示）来计算效率，在分批发酵过程中，必须计算全过程的生产率，即时间不仅包括发酵时间，而且也包括放料、洗罐、加料、灭菌等时间。 连续发酵 所谓连续发酵，是指以一定的速度向发酵罐内添加新鲜培养基，同时以相同的速度流出培养液，从而使发酵罐内的液量维持恒定，微生物在稳定状态下生长。 稳定状态可以有效地延长分批培养中的对数期。 在稳定的状态下，微生物 所处的环境条件，如营养物浓度、产物浓度、 pH 值等都能保持恒定，微生物细胞的浓度及其比生长速率也可维持不变，甚至还可以根据需要来调节生长速度。 连续发酵具有以下优点： ①可以维持稳定的操作条件，有利于微生物的生长代谢，从而使产率和产品质量也相应保持稳定；②能够更有效地实现机械化和自动化，降低劳动强度，减少操作人员与病原微生物和毒性产物接触的机会；③减少设备清洗。 准备和灭菌等非生产占用时间，第二章 工艺设计 9 提高设备利用率，节省劳动力和工时；④由于灭菌次数减少，使测量仪器探头的寿命得 以延 长，节约了成本；⑤容易对过程进行优化控制， 有效地提高发酵产率。 当然，他也存在一些缺点 : ①由于是开放系统，加上发酵周期长，容易造成杂菌污染；②在长周期连续发酵中，微生物容易发生变异；③对设备、仪器及控制元器件的技术要求较高；④粘性丝状菌菌体容易附着在器壁上生长和在发酵液内结团，给连续发酵 操作带来困难。 由于上述情况，连续发酵目前主要用于研究工作中，如发酵动力学参数的测定，过程条件的优化试验等等，而在工业生产中的应用还不多。 连续培养方法可用于面包酵母和饲料酵母的生产，以及有机废水的活性污泥处理。 而新近发展的一种培养方法则是把固定化细胞技术和连续培养 方法结合起来，用于生产丙酮、丁醇、正丁醇、异丙醇等重要工业溶剂。 补料分批发酵 补料分批发酵又称 流加发酵， 半连续发酵，是介于分批发酵和连续发酵之间的一种发酵技术，是指在微生物分批发酵中，以某种方式向培养系统补加一定物料的培养技术。 通过向培养系统中补充物料，可以使培养液中的营养物浓度较长时间地保持在一定范围内，既保证微生物的生长需要，又不造成不利影响，从而达到提高产率的目的。 如今， 流加发酵 的应用范围已相当广泛，包括 单细胞蛋白。