富硒金针菇菌株的选育毕业论文(编辑修改稿)

富硒金针菇菌株的选育毕业论文(编辑修改稿)内容摘要：

现。 在高温季节，培养基灭菌后，待锅内温度降至 50℃ 时，取出大试管， 将 大 试管头部枕在 小 木条上，使管内培养基自然倾斜， 斜面长度为试管长度的 ⅔， 覆盖保温物让其自然缓慢冷却， 凝固后即成斜面培养基。 ⑬ 斜面无菌检验 将灭菌后的斜面放置 28℃ 恒温箱内培养 3d，剔除被污染的斜面。 富硒金针菇菌株的选育毕业论文 5 菌丝体 转管 ① 材料准备 接种钩、 棉球、 镊子、 75%酒 精 棉 球 、 75%酒精、金针菇母种培养基、 酒精灯 ② 超净工作台的灭菌 在接种前，取 75%酒 精 棉球 蘸上 75%酒精将超净工作台表面 消毒，将待接种的斜面培养基放入超净台内，并开启紫外线灯灭菌 30min。 ③ 取 75%酒 精 棉 球 蘸上 75%酒精擦拭双手、超净台的工作台面、接种工具、金针菇母种试管的表面。 ④ 菌丝体的转管 点燃酒精灯开始接种操作。 接种操作需靠近火焰，但注意不要灼伤菌种。 将所要母种和斜面培养基用大拇指和其他四指并排握住，斜面向上，并使试管位于水平位置。 右手轻轻松动棉塞，以利于接种时能较容易的拔出。 右手拿接种钩，在装有酒精的瓶子中蘸一下，然后在火焰上烧红，进行灼烧灭菌。 用右手小指和无名指拔掉棉塞。 在火焰上灼烧试管口，灼烧时应转动 试管，将其沾上的少量杂均烧死。 将灼烧过的接种钩伸入母种试管内，放在试管内壁停留片刻使之冷却以免烫伤菌种。 在菌丝浓密处， 取出 178。 大小的菌种块，迅速抽出，不要碰到管壁。 迅速通过酒精灯火焰无菌区，把菌种块送入斜面培养基的中央。 灼烧试管口，并将棉塞在火焰上迅速过一下，塞上。 将接种钩在火焰上灼烧至红，放回超净台。 将接好的试管贴上标签，注明菌种名称和接种时间，放在25℃培养 9d 长满斜面。 紫外诱变 ① 材料准备 报纸 、棉球、 75%酒精、 75%酒精 棉球 ② 仪器准备 培养皿、 酒精灯、 电热恒温鼓风干燥箱 、电 炉 ③ 培养皿 干热灭菌 取培养皿 12套，洗净后晾干。 取 6套培养皿，使用报纸包扎 起来。 另外 6套的处理方法与此相同。 将上述 12 套培养皿 放入 电热恒温鼓风干燥箱 灭菌， 将其温度设置为 130℃，时间设置为 4h。 ④ 超净 台的灭菌 取 75%酒精棉球 蘸 上 75%酒精将超净工作台表面消毒，并开启紫外线灯灭菌 30min。 ⑤ 融化培养基 将 装满水的锅放置电炉上，插上电源，加热。 内部装有综合马铃薯培养基的锥形瓶放置在锅内，水浴加热。 培养基完全融化后取出，放置在超净台上。 ⑥ 倒平板 取酒精棉球，蘸上酒精后，擦拭锥形瓶表面。 趁热倒平板， 培养 皿的握法 如下： 将已灭菌的培养皿放置在超净台上。 点燃酒精灯。 右手 小拇指和无名指拖住培养皿的底部，大拇指和中指卡在培养皿的侧面，食指扣在培养皿的上部。 在酒精灯火焰的无菌区，将锥形瓶中的培养基倒在培养皿中，厚度以培养基能覆盖培养皿底部即可。 富硒金针菇菌株的选育毕业论文 6 ⑦ 平板无菌检验 将平板放置 28℃ 恒温箱内培养 3d，剔除被污染的平板。 ⑧ 超净台 的灭菌 ⑨ 接种 点燃酒精灯，将复壮后的白色金针菇和金针菇 201，使用接种钩， 在菌丝浓白粗壮处 取出 178。 大小的菌种块。 在火焰无菌区，左手拿培养皿，将菌种块转接至平板上。 ⑩ 菌丝体紫外诱变 将超 净台面清理干净，使用酒精棉球蘸上酒精，擦拭超净台面。 揭开培养皿的盖子，开启紫外灯，直接照射菌种块上的菌丝体，进行紫外诱变，一批照射 5min，一批照射 10min。 ⑪ 恒温箱培养 紫外诱变后，将平板放置 电热恒温培养箱 中培养 9d。 菌丝体的活化与复壮 ① 将 中获得的金针菇 201 和白色金针菇菌丝体，继续转管 2次，每次培养 9d。 ② 将 中获得的诱变体 、 、白 .白 .10 转管 2 次，每次培养9d，使其活化。 ③ 每次转管都应在菌丝浓白粗壮处挑取菌种块。 菌种 保藏 菌种保藏的目的就是使菌种在较长期的保藏之后，不被杂菌污染，仍能保持原有的生活力和生产性能，其形态特征、理化特性和遗传性状不会发生改变。 稳定的保藏保证了优良菌株的高产优质，也可以作为分离菌株的对照和验证研究结果。 菌种保藏的 原理就是通过降低营养、 缺氧 、干燥、低温等手段，降低菌株的新陈代谢， 使菌种暂时处于休眠状态， 抑制菌丝的生长和繁殖，从而降低其变异率。 菌种保藏的方法有多种，斜面低温 保藏法、 液体石蜡保藏法、半固体穿刺保藏法、沙土管保藏法、加入保护剂冻存保藏法、冷冻真空干燥保藏法等 [11]。 我们采用斜面低 温保藏法，具体方法是将金针菇菌种接种于马铃薯 综合 培养基中，25℃ 条件下培养。 培养过程中要勤检查 ,当菌丝 体 长满斜面 ，及时挑选无污染、菌丝浓白粗壮的固化菌种 ,放在 4℃冰箱中保藏 ,每隔 3 个月时间移植转管一次。 保藏时 棉塞部分 需用灭过菌 的牛皮纸包扎棉塞 ,以防 培养基干燥 ，也可降低 污染的机会。 固化 富硒 培养 本次实验，我 将培养基富硒浓度梯度设置为 0、 1 2 340(μg/L)[12]。 ① 配置 固化 CM 培养基 取 9个锥形瓶编号。 向 9个锥形瓶中各加入硒储备液 0、富硒金针菇菌株的选育毕业论文 7 8mL。 配置固化 CM 培养基，分装至锥形瓶中， 200mL/个，摇匀，获得各个硒浓度梯度的固化 富硒 CM 培养基 母液。 ② 灭菌 锥形瓶用 8 层纱布、牛皮纸包扎后，放入灭菌锅中灭菌。 温度设置为115℃ ，时间为 30min。 打开超净台上的紫外灯，灭菌 30min。 ③ 倒平板 在超净台灭菌后，取已灭菌的培养皿 54 套。 取出锥形瓶，将 200mL富硒 CM 培养基 母液 分装至 6 套培养皿。 将培养皿贴上标签。 白 . 中的“ 0”代表培养基含硒量为“ 0”，其他以此类推。 ④ 平板无菌检验 将已灭菌的斜面置于 25℃ 恒温箱内培养 3d，只有培养基表面及基质内无任何杂菌菌落出现，说明已达到灭菌目的，才可使用。 ⑤ 接种 将金针菇母种接种至富硒培养基，其中母种设置为 田野金针菇 20野树林白色金针菇 ，诱变梯度设置为 10min，硒浓度梯度为 0、 1 2 3 40（ μg/L）。 设置一不接种的、不含硒的空白对照。 ⑥ 富硒培养 将平板置于 电热恒温培养箱 25℃ ，培养 9d。 液体富硒培养 我们将培养基富硒浓度梯度设置为 0、 1 2 40（ μg/L）。 ① 配置液体 富硒 CM 培养基 取 8个锥形瓶编号。 向 8 个 大 烧杯 中各加入硒储备液 0、 1 1 1 24mL。 配置 液体 CM培养基， 向各个烧杯中加入液体 CM 培养基 600mL，摇匀，获得各个硒浓度梯度的 液体 富硒 CM 培养基 母液。 ② 分装 取干净的锥形瓶 48套。 将 每个 600mL 富硒 CM 培养基 母液 分装至 6 个锥形瓶 中， 贴上标签。 ③ pH 测定 使用 数字式 pH 计 测定锥形瓶中的 pH， pH 自然即可。 ④ 培养基、超净台的灭菌 ⑤ 液体富硒培养基的无菌检验 与斜面无菌检验方法一致，在 25℃ 恒温箱内培养 3d 后，只有当发酵液依然保持原来的清 澈程度，才可使用。 ⑥ 接种 将金针菇母种接种至富硒培养基，其中母种设置为 田野金针菇 20野树林白色金针菇 ，诱变梯度设置为 10min，硒浓度梯度为 0、 1 2 3 40（ μg/L）。 设置一不接种的、不含硒的空白对照。 ⑦ 富硒培养 将平板置于 全温培养摇床 ，温度设置为 25℃ ， 250r/min， 培养 9d。 固化 金针菇菌丝的形态学检测 ① 测定菌丝 粗细、 疏密 程度 、色泽。 ② 测定 菌落 半径 利用 十字交叉法 ，用游标卡尺测定 菌 落 生长 直径。 计算菌丝平均生长速率。 ③ 测定菌 丝直径 [13] 使用镜台测微尺将显微镜的目镜测微尺校准。 在载玻片上滴一滴乳酸 石炭酸 棉蓝染色液，用镊子取出菌丝，放置在染色液中，使用 40 倍富硒金针菇菌株的选育毕业论文 8 目镜测定其直径。 ④ 测干重 使用镊子 尽量将培养基上的菌丝挑取出来，并且不可沾上培养基。 收集菌丝体于称量瓶，在电热恒温干燥箱（温度设置为 60℃ ）中烘干至恒重，用 电子分析天平 称其干重。 液体培养 金针菇菌丝 球 的形态学检测 ① 观察菌丝球的色、香、味 、 测定菌液 pH、 测菌丝球数目 [14]。 ② 测菌丝球直径 将液体富硒培养所获得的金针菇菌丝球 及其培养基，倒入培养皿中。 在大大小小的菌丝球中，选择其中较大的 3个和较小的 3 个，使用游标卡尺测定这 6个菌丝球的直径，从而得出该培养基菌丝球的直径范围。 ③ 测干重 使用 2 层纱布过滤液体富硒培养基中的菌丝球，置于 培养皿 ，加入蒸馏水充分洗涤，过滤。 如此反复 5 次。 收集菌丝球于称量瓶，在电热恒温干燥箱（温度设置为 60℃ ）中烘干至恒重， 用电子分析天平 称其干重。 ④ 计算菌丝体生物量 菌丝体生物量是菌丝体干重 （ g） 与液体培养基体积 （ mL）的比值 [15]。 紫外分光光度法测定金针菇菌丝体中的含硒量 在参考文献地基础上 [16]， 我们做了改进 ： 明确了硫酸高氯酸消化时间和水浴锅加热反应时间， 我们通过在通风处操作以及将锥形瓶盖上塞子，防止具有刺激性气味的白雾进入空气，危害身体健康， 将其中激烈反应这一并不明显的特征表现删除， 将冒白烟这一特征改成冒白雾，其出现的时间我们按照实验事实做了更正， 使用 100℃ 水浴锅代替电沙浴达到节能效果， 菌丝体与子实体不同，我们根据实验，将文献中加分析纯 改为 ， 明确提醒出可能会出现问题的地方，防止操作不慎产生恶果， 提醒使用塑料瓶盛装浓 NaOH 溶液， 硫酸高 氯酸消解液配置好后应避光保存 ， 因 EDTA溶解度较低，实验中使用 EDTA 二钠盐代替 EDTA。 ① 消化 使用电子分析天平称取金针菇菌丝粉末 （平板获得的菌丝体取）， 置于 250mL 锥形瓶中，使用移液管加入硫酸高氯酸消解液 12ml，塞上橡胶塞。 在室温下放置 24h，瓶中菌丝粉末被消化成糊状。 ② 提硒 打开水浴锅，温度设定为 100℃。 在通风处，向锥形瓶中加入钼酸钠溶液 3ml，可看到冒出白雾，钼酸钠加入完毕后迅速将塞子塞上，防止白雾扩散至空气中。 轻轻地水平地摇匀 1min，以防粉末颗 粒粘到了锥形瓶的侧壁，导致消化不完全。 然后将其放置在水浴锅中加热，瓶中产生大量翻滚的白雾。 加热1h 后，即溶液由糊状变成淡黄色时，取出锥形瓶置于台面上冷却。 向溶液中加入蒸馏水 35mL。 在通风处，加入分析纯 ，此 NaOH 固体应少量多次加入，每次加入后摇匀，使其完全溶解，防止溶液爆沸。 反应放热并有刺激性气体富硒金针菇菌株的选育毕业论文 9 使用 8mol/LNaOH 溶液和 pH 计调混合溶液 pH 为中性。 依次加入 40%盐酸羟胺溶液 2mL、 、 1:1(V/V)磷酸溶液 2mL,加塞摇匀 1min。 ③ 萃取 向 溶液加入 %邻苯二胺溶液 2mL,摇匀后静置 2h。 开启紫外分光光度计预热，设置波长为 335nm。 将锥形瓶移至紫外分光光度计旁的通风处 ,使用移液管加入甲苯 10mL,振荡 1min,将混合液倒入大试管 （ 70mL） 中 ,将大试管放入试管架上，静置 10min。 ⑤ 测定 取上层甲苯于石英比色皿中，测 吸收 值。 标准曲线的制作 分别 取硒 标准液 0， ， ， ， ， ， 于 250 mL锥形瓶中 ，相当于分别含硒 0， 6， 12， 18， 24， 30μg/mL， 经过消化、提硒、萃取、测定步骤后，获 得其在 335nm处的 吸收 值。 以硒含量为横坐标，吸收值为纵坐标绘图。 以吸收值 A对硒含量回归，获得回归方程。 富硒金针菇菌株的选育毕业论文 10 3 结果与分析 （讨论） 紫外诱变对金针菇形态学特征的影响 紫外诱变 实验中 ，选择金针菇 201 和白色金针菇两个菌种。 我设置了 0、 10min 中的时间梯度，随后在平板中培养，发现紫外诱变时间越长，菌丝体的生长速率明显下降，并且菌丝越显得瘦弱。 金针菇在液体富硒培养中的特性 针对菌丝培养后硒含量的测定，我使用石英比色皿和玻璃比色皿制作了两个标准曲线，数据表格及曲线图见表 1~2 和图 1~2。 实 验中，针对金针菇 20白色金针菇及其紫外诱变菌种进行了条件优化的液体富硒培养，使金针菇菌丝体在液体培养基中能够充分的接触到培养基。 在液体富硒培养中，可以得出金针菇菌丝体各个菌株的不同特性。 观察 发酵液的浊度，菌丝球的色、香、味 及其形状 ，测定菌液 pH 和菌丝球直径，测菌丝球数目及其干重 ，记录各个菌种各个梯度菌丝球干燥所需的时间。 通 过对上述菌 株的生长状况进行了。