基于卟啉荧光增强的微生物水体总毒性测试方法研究_毕业论文(编辑修改稿)

基于卟啉荧光增强的微生物水体总毒性测试方法研究_毕业论文(编辑修改稿)内容摘要：

例如，对于低浓度金属样品，盐度校正会导致假阴性的结果；而对于一些溶解度低的样品，如苯酚，则会由于毒物的析出而导致假阳性结果；（ 3）单一发光细菌的使用难以做到适用于所有毒物。 因此，其应用范围受到了很大限制。 此外，许多 微生物受到毒性物质侵害后，会表现为活性下降、呼吸活性变弱，生理状态发生变化等。 基于这个原理，研究者将硝化细菌、硝化细菌富集培养物用于有毒物质的毒性检测，通过测定硝化细菌的呼吸速率的变化来检测废水毒性，测得毒物的 EC50 值与发光菌法具有较好的相关性，该方法适用于测试城市污水和工业废水的毒害作用，也适用于河道底泥的毒性检测，应用该方法已经成功开发出毒性测试仪 [23,24,25]。 本 论文 的研究内容和意义 我们 在前期的工作中提出了使用亚甲基蓝和中性红染料为指示剂的水体总毒性微生物光学检测方法 [26]。 当有毒性物质存在时，细胞膜的结构被破坏，从而允许更多的染料进入细胞内，通过光学检测剩余染料的浓度即可实现对毒性的检测。 毒性物质对细胞膜造成伤害，一方面允许细胞外的物质进入细胞，另一方面也会允许细胞内的物质流出。 因此细胞内的流出物可以作为细胞膜破损的标志。 钾离子是细胞内普遍存在的无机离子，微生物通过位于原生质膜上的离子通道蛋白 Na+， K+ATP 酶的作用将钾离子运输进入细胞内，在细胞内形成高浓度的钾离子 [27]。 当细胞膜被毒性物质破坏时，细胞内的钾离子就会流出细胞，导致细胞外的钾离子浓度升高。 通过检测钾离子浓度的变化，就可以实现对毒性的检测。 到目前为止，长春工程学院（毕业论文） 5 还没有人报道过这种毒性测试方法。 此外，某些蛋白质，酶等胞内物质也可以在细胞膜破损后流出细胞，因而原则上这些物质都可以作为毒性物质的指示剂。 但是，与钾离子相比，它们所需要的细胞膜上的孔洞相对较大 [28]，因而不适合用于低浓度毒性物质或者低毒性物质的检测 [29]。 1998 年 Periasamy 等人系统的研究了卟啉分子与表面活性剂分子之间的相互作用，指出了表面活性剂分 子对卟啉荧光的增强机理 [30]。 同时，我们也知道微生物的代谢过程会释放出大量的类似表面活性剂的分子，因此可以预见微生物的代谢物溶液可以有效的增强卟啉的荧光。 而荧光的增强程度与微生物的代谢物浓度，即微生物的活性有直接的联系。 基于这个机理，我们就可以开发出一种新颖的微生物水体总毒性检测方法。 2 实验部分 化学物质 长春工程学院（毕业论文） 6 试剂 公司 备注 氯化钠 北京化学试剂公司 用来配制培养基 蛋白胨 北京奥博星生物技术有限责任公司 用来配制培养基 YEAST EXTRACT OXOID 有限公司 用来配制培养基 大肠杆菌 中国普通微生物菌种保藏管理中心（ CGMCC） 4℃ 冰箱中保藏 KH2PO4 北京化学试剂公司 用来配制磷酸盐缓冲溶液 Na2HPO4 北京化学试剂公司 用来配制磷酸盐缓冲溶液 HCl 北京化学试剂公司 用来配制磷酸盐缓冲溶液 NaOH 北京化学试剂公司 4℃ 冰箱中保藏 卟啉（ 1mmol/L） 北京化学试剂公司 4℃ 冰箱中保藏 DCP（ 10g/L） 阿拉丁试剂公司 4℃ 冰箱中保藏 磷酸盐缓冲溶液（ PBS）是自制的。 制备方法： 将 12H2O 溶于 1000ml 的二次水中，添加 1MHCl 和 1MNaOH 把PBS 的 pH 值调至 . 仪器 长春工程学院（毕业论文） 7 仪器 型号 厂家 多振幅轨道摇床 ZHWY200B 上海智城分析仪器制造有限公司 超声波清洗器 MW5065 昆山市超声仪器有限公司 台式冷冻离心机 Centrifuge 5804 R EPPENDORF 荧光光谱仪 FLUOROMAX4 紫外可见分光光度计 Cary 500 美国瓦里安公司 实验内容 微生物培养 大肠杆菌（ DH 5α）的最适培养基和培养温度均是参照 CGMCC 和上海智城分析仪器制造有限公司说明书设定的。 所用的微生物均在转速为 190rpm 的摇床中培养。 15℃ 下离心 5 分钟，转速 5000rpm，用 1%NaCl 洗涤两次。 然后用 1%NaCl 将微生物制备成悬浮液保存于 常温的环境中，所用的微生物都是当天使用，不能过夜。 卟啉 的 荧光 增强 比较测定有毒化学物质 把微生物用 磷酸缓冲溶液（ PBS） 稀释到所需的 OD 值，再用紫外可见近红外扫描分光光度计测量微生物 OD 值，其波长选在 600nm。 所用的有毒物质（ 10ppmDCP）都是在实验初期事先配制好的，使用时用二次水将其稀释至实验所需的浓度值。 在实验中，样品包含 400ul微生物悬浮液， 100ul有毒化学物质和 500ul PBS。 同时，空白样和实验样品添加的其他物质都用 PBS 来补充，所有的填补都是相同的。 样品在有铝箔包裹下放入多振幅轨道摇床摇晃 60 分钟，然后取出离心得到上层清液。 这时的样品中包含 500ul 上层清液 ， 400ul PBS和 100ul 卟啉，测定各个试样的荧光光谱图并进行对比。 而毒性检测的原理是对比健康的微生物细胞和受到毒性物质损害的细胞对卟啉荧光增强的峰值的差异。 这样的分析方法是测定上层清液中微生物代谢物的浓度与卟啉的荧光作用，使得实验操作起来比较简便，同时也简化了实验过程。 依据这个原理，毒性的大小是可长春工程学院（毕业论文） 8 以通过毒性物质对微生物释放的钾离子的抑制率 来 进行检测，计算公式为 Inhibition Ratio（ %） =（ 1−𝐀−𝐂𝐁−𝐂） 100% A 是在有毒性物质的环境中培养的微生物后，上层清液的微生物代谢物与卟啉在 621nm处的荧光峰值 与在 636nm 处的荧光峰值的比值 ； B 是 在没有有毒性物质的环境中培养的微生物后， 上层清液的微生物代谢物与卟啉 在 621nm 处的荧光峰值 与在 636nm 处的荧光峰值的比值 ； C 是 空白样 （没有摇床的微生物代谢物与卟啉） 在 621nm 处的荧光峰值 与在 636nm 处的荧光峰值的比值。 注：每个样品都做两个平行样，故计算时要取其平均值。 结果和讨论 原理 图 1 是本论文 基于微生物的代谢物对卟啉荧光的增强作用原理进行检测。 当有毒性物质存在的时候，微生物的细胞膜受到抑制，使其释放出来的钾离子减少，从而测得的荧光现象逐渐减弱。 通过对比荧光现象的峰高，就可以实现对毒性物质的检测。 由于 3， 5二氯苯酚（ DCP） 的毒性较小、价格便宜、容易用荧光仪检测，所以本实验选用 DCP。 此外，实验最终现象是无毒性物质的荧光增强作用要比有毒性物质的高。 : PBS ： microanisms 图 1 基于卟啉荧光增强的微生物水体总毒性测试原理 长春工程学院（毕业论文） 9 图 1 的实验过程如下： （ 1） E． Coli/ul DCP/PBS/ul PBS/ul 总量 /ml 400 100 500 1 （ 2） 上层清液 /ul PBS/ul 卟啉 /ul 总量 /ml 500 400 100 1 注：在步骤（ 1）完成后要在摇床中培养 60 分钟后取出离心得到上层清液。 在步骤（ 2）中，没有加卟啉之前要静置 60 分钟，使得样品中的各种反应进行完全，以便得到更加稳定的作用。 DNA 的选用对毒性测试的影响 由于卟啉与 DNA 的相互作用会导致荧光光谱性质发生变化，为了使得实验的测试结果 荧光增强 比较显著，则 实验初期要 考虑 是否 使用 DNA。 图 2A 和图 4B 是两种不同的 DNA， 图 2B 中的 DNA 是实验初期一直 使 用的。 在 实验操作和其他条件都相信的情况 下，只改变 DNA 的种类 ， 但 出现的荧光 增强 现象是不同的。 很明显， 图 2A 中的 荧光增强 现象比较混乱，没有一定的规律；而 图 2B 中的 荧光增强 现象 与实验最终结果一致， 表明： DCP 会抑制微生物释放钾离子，从而荧光现象会降低。 因此，依据图 2B 的 荧光增强 现象，则选用 Add 280ulH2O DNA 可以稳定实验现象。 在实验过程设计完成后，我们需要改变实验过程中的单一变化条件 （改变微生物的浓度和反应时间） ，以便 得到优化的实验条件，如图 2C、 D、 E、 F和 G。 由图 2C和 2D 我们可以看出，证实了选用 DNA 得到的荧光现象要比没有选用 DNA 得。