基于sf9昆虫细胞的蓝光诱导表达系统的构建毕业论文(编辑修改稿)

基于sf9昆虫细胞的蓝光诱导表达系统的构建毕业论文(编辑修改稿)内容摘要：

mall application is never limited to the insect cells, also functional in many vertebrates cell. This assay to apply the system in sf9 cells is the first time in the word. Keywords: Baculovirus Expression Vector, Optical expression system, insect cells . 缩略词表 Amp Ampicillin 氨苄青霉素 LB LuriaBertani culture medium LB 培养基 FBS Fetal bovine serum 胎牛血清 PCR polymerase chain reaction 聚合酶链式反应 GFP Green Fluorescent Protein 绿色荧光蛋白 BEV Baculovirus Expression Vector 杆状病毒表达载体 SNP Single Nucleotide Polymorphisms 单核苷酸的多态性 SM Streptomycin 链霉素 华中农业大学 20xx届本科毕业论文 1 1 前言 诱导型启动子 天然诱导型启动子 (inducible promoter)是指自然界天然存在的在某些特定的物理或化学信号的刺激下，该 种类型的启动子可以大幅度地提高 基因 的转录水平。 目前已经分离了光诱导表达 基因 启动子、热诱导表达基因启动子、创伤诱导表达基因启动子、真菌诱导表达基因启动子和共生细菌诱导表达基因启动子等。 长期进化过程中，生物通过启动不同 基因 的表达可在一定范围内适应光、温、水等环境的变化。 这些 基因 的启动子通常包含比较保守的 顺式作用元件 ，利用这些保守元件可以推 测新基因的可能功能，也可用这些环境应答基因的启动子与抗逆 基因融合 ，从而使转基因生物更好地适应逆境。 由于生物生长环境及基因表达的复杂性，从外界环境的刺激到启动应答基因的表达之间的信号通路往往是相互交 叉的，这样启动子中包含的顺式作用元件通常也不止一种。 在开发植物天然存在的诱导型启动子的基础上。 人工构建可诱导表达系统以满足不同需求。 目前研究最多、最深 入的可诱导表达系统是化学诱导表达系统。 自第一次用化学诱导表达系统 TetR，通过 CaMV35S 启动子成功调节 cat基因的表达以来已有 20 多年的 历史，现已发展成日臻完善的植物表达外源基因的可诱导表达系统。 该系统包括两个转录单元：一是与化学诱导物结合的转录因子的表达，另 一个转录单元包含一个应答元件，经诱导物处理后，通过它激活转录因子，从而激活或抑制目的基因的表达。 一个理想的化学诱导表达系统应具备以下特点：首先，外源基因在植物体自身不表达或低水平表达，当添加诱导 物后，高效诱导基因表达；其次，诱导物需要有较强的专一性；第三，诱导物可快速启动基因表达的“开”与“关”；而且诱导物对植物无毒 或低毒。 根据控制基因表达的方式，可将化学诱导系统分 为两大类：阻遏型启动子系统和激活型启动子系统。 人工诱导启动子使人为控制基因表达成为可能。 1， 2 基 于 sf9细胞的蓝光诱导表达系统的构建 2 1）阻遏型启动子系统 该系统建立在阻遏蛋白与转录因子在空间构型相互作用的基础之上。 当诱导物不存在时，激活蛋白与阻遏蛋白结 合，基因正常转录；添加诱导物后，诱导物与激活蛋白结合或阻止其与阻遏蛋白结合，阻遏蛋白则与启动子上的某些顺式作用元件结合，抑制 基因转录，如以四环素抑制子为基础的四环素抑制系统 (tTA)。 Love 等用包含四环素抑制子的启动子 Topl0 与报告基因 GFP 相连转化拟南芥，发现 用 100 ng/mL 的四环素即可抑制 GFP 的表达，而且改变培养基中四环素的浓度，可调节 GFP的表达水平。 2）激活型启动子系统 在抑制型启动子系统中，抑制基因转录所需诱导物的量往往超出植物适应的范围，而且在真核生物中激活基因比 抑制基因转录更容易，近年发展了一些激活型启动子系统，如地塞米松诱导的 GR 系统、雌二醇诱导的 ER 系统、杀虫剂诱导的 EcR 系统等。 激活型 启动子系统的优点是只有当诱导物存在时才能启动基因表达，去除诱导物后，基因表达很快被关闭，这样就可以人为地精确、快速控制基因的表达。 光诱导启动子 人工诱导 型还有一颗新星，光诱导表达启动子，简称光控启动子。 光控表达系统可以在空间和时间上精确控制转录，这和很多传统的诱导表达启动子不一样 3。 光控启动子，由于其在时间和空间上对基因表达高精度的控制性而很受很多领域研究的欢迎。 光作为光控启动子的诱导因子，具有其它各种诱导型启动子诱导条件无与伦比的优势。 首先是敏捷度高，从接受刺激到产生效果只需要很短的时间，而当诱导物是其它物质时，从接受刺激到产生效果很大程度上受限于化学分子的扩散速率，而扩散速率由于很多其它因素有关，诸如温度、分子大小等，这些因素的存在使得实验条件不易精确 控制。 再者光在某种程度上是完全无毒的 对细胞中其它的生化反应无任何影响的条件，这是非光诱导因子所不能做到的，光的激活和去激活作用完成一个循环后在细胞中可以做到零残留，这使得实验条件控制更加理想化，少了一个不可控的变量 5， 6。 另外，对于精确度的掌握，光的剂量控制显然比化学物质的剂量控制更方便也更科学。 对于精度要求高的生物实验很是适合的。 当前已被开发出来的光控启动子华中农业大学 20xx届本科毕业论文 3 大多有一个共同的缺点：对目标基因表达量的调控范围较窄。 如能在此方面有重大突破，将带来光遗传学的一场革命。 本文将讲述的一个光控表达系统一定程度上相对 其它光控系统具有一定的优势。 光诱导启动子一般都会依赖于一个光敏转录因子，而这类光敏转录因子大多是通过人工改造光敏蛋白得到。 7， 8， 9 VPEL222转录激活系统 EL222 转录因子，最初源于一个细菌的光 氧 压蛋白 10，被蓝光照射时就会二聚化结合到 DNA 上。 这个系统对控制表达的目标蛋白有足够大的的可调表达范围，敏捷的激活和去激活作用，以及对光强足够高的线性相关性。 通过这个系统，已在多种哺乳动物细胞中测试了光控转录作用。 这一方法对在时空上精确控制基因表达是一个强大的工具。 这个系统的光依赖转录激活作 用只需少量元件，一个光敏结构域 LOV11，一个螺旋 转角 螺旋（ HTH） DNA 结合结构域。 黑暗时 LOV 结构域结合者HTH 结构域，覆盖了对于成为二聚体而结合到 DNA 所必需的 HTH4α位点。 蓝光照射会触发光化学反应： LOV 结构域中的黄素蛋白复合物打断了 LOV 和HTH 的相互作用，使 EL222 二聚化，从而发挥 DNA 结合蛋白活性 12， 13。 这些反应在黑暗中又会反过来进行，其逆反应在停止蓝光照射后将很快发生，这是快速去激活作用的基础。 在 EL222 原始宿主中，发现这个基因的光依赖激活作用与基因组上的 EL222结合位点毗邻， 暗示这个蛋白质是一个光敏转录因子。 对 EL222 机制的理解使我们能够在单一蛋白质复合系统中使用光依赖基因激活作用。 在这里我们将报告一个经过基因工程改造的 EL222。 在接收适当蓝光照射条件下，能在不同真核表达系统中激活转录。 通过这个方法，在 293T细胞中应用这个系统已被证明了富集倍数超过 200 的过表达。 与之对照，在最小泄露的非诱导条件下，黑暗条件和红光照射富集倍数只能有小于 2 的改变。 这个系统有快速的激活（ 10s）和去激活能力（ 50s），这与另一种同样以LOV 为基础的光控系统形成鲜明对比，该系统的去激活能力 小于 2 小时。 而且，这个系统可以实现对细胞进程的功能性调节，因为已经证明光控调节 293T细胞的剪切作用。 最后，在斑马鱼中已证明不论是全身还是组织特异性的基因都适用利用 EL222 来实现最低毒性的光控表达，扩大了这个表达系统的应用范基 于 sf9细胞的蓝光诱导表达系统的构建 4 围。 总之，已掌握的资料和数据突出了 EL222 系统宽广的通用性以及它作为光遗传学工具的优势。 VPEL222系统在 293T细胞中的表现 此系统由 Laura B MottaMena等最先从 293T细胞中发展而来 14，在推广该系统前，已经做了大量的验证实验。 对于图 1，左侧是转染后 的实时数据，右侧是获得稳定细胞系后的数据。 对比光照和黑暗， VPEL222 系统的转入与否，从图中可以很清晰地看到 VPEL222系统在 293T细胞中工作效率很高。 该实验中使用的报告基因是萤火虫荧光素酶基因，通过该酶的活性测定获得该基因的表达活性 14。 图 293T细胞中的表现。 （ a）四组细胞均被转染 pC120Fluc，第一组细胞转染空的不含 VPEL222的质粒，第二组转染含 VPEL222的质粒（ pVPEL222），第 三组细胞为 293T野生型，第四组细胞为转染 pVPEL222后获得稳定表达VPEL222细胞系，四个组各自分光照和黑暗两小组。 （ b）转染 pC120mCherry后的293T野生型细胞和稳定表达 VPEL222蛋白的细胞在光照黑暗两种条件处理后的荧光显微镜下的图像。 华中农业大学 20xx届本科毕业论文 5 pMIB/V5His载体 pMIB/V5His 载体分 A、 B、 C 三型，这次实验中使用的是 A 型，从Invitrogen公司购买。 该载体主要用于帅选被转染的细胞，以及用于在鳞翅类昆虫细胞系中稳定表达外源蛋白。 原始载体全长约 ， ori来自 pUC 质粒，还有用于在大肠杆菌中筛选的氨苄青霉素（ AMP）抗性基因和在昆虫细胞中筛选的杀稻瘟菌素（ Blasticidin）抗性。 初始载体图谱（图 2.）。 该载体通常只用于在昆虫细胞中表达外源蛋白，在其上的多克隆位点中可以很容易插入一段外源序列，而此次我们需要其表达三个外源蛋白： mCherry 红色荧光蛋白、 EL222转录因子、 GFP 绿色荧光蛋白，所以，我们采取让后两者串联表达的方案（使用 2A自剪切多肽）。 也切掉了 OpIE2启动子，详细构建步骤后面会说明。 图。 当前应用较广的杆状病毒表达系统已经使用较为成熟，它的优点已有目共瞩。 但用作某些特定需求的基础研究则会显得力不从心，如当需要对目标蛋白进行实时控制时。 前者在某种程度上更加类似于化学诱导系统，至于化学诱导启动子和光诱导系统的优劣比较，前面已有详述，此处不再赘述。 在 sf9 昆虫细胞中建立一个光诱导表达系统，并获得稳定表达细胞系，将使对目标蛋白表达的调控更加灵活。 特别是当我们的目的蛋白是作为功能蛋白时，此时对该蛋白的实时表达控制，即是对一个代谢通路的调节与控制。 本实验中在 sf9 细胞中建立的光控表达系 统，已有报道在 293T 细胞中实验成功，也可以说，这个系统是最初从 293T 细胞中建立起来的 14，我们所做的工作是把该系统移植到基 于 sf9细胞的蓝光诱导表达系统的构建 6 sf9 细胞中来。 首先我们需要测试该系统是否能移植到 sf9 细胞中，以及其在sf9 细胞中的稳定性，我们采用 mCherry 红色荧光蛋白基因作为报告基因。 通过分析，定性得到该光控系统的调节能力。 因此这篇文章作为先导文章，通篇并不涉及该光控表达系统的实际应用，只是为后面能深入应用该系统做铺垫。 实验材料 材料与试剂 pMIB/v5hi。