译文--土壤微生物多样性：生态学理论，分子技术的应用和转基因植物、转基因微生物的影响(编辑修改稿)

译文--土壤微生物多样性：生态学理论，分子技术的应用和转基因植物、转基因微生物的影响(编辑修改稿)内容摘要：

109 340 污泥修复的土壤；未污染的 7800 1010 9800 污泥修复的土壤；低金属的 3700 1010 4600 污泥修复的土壤；高金属 的 1200 109 1500 注： 土壤群落 DNA 大小用碱基对（ bp），相等的大肠杆菌基因组（ ： 106bp）（ (Br248。 nstad等 . 1996。 Dr248。 nen 等 . 1998）。 C0代表摩尔核苷酸每升， t 代表时间 /秒 为了估计原核生物的多样性， DNA必须高度纯化并且与真核生物的 DNA区分开来。 因此，必须使用一种间接地 DNA 提取方法将土壤中的细菌分离开，即在细胞溶解之前进行分级离心。 另外， 为了更加精确地估计高纯度的 DNA，必须使用统一的片段长度。 从土壤微生物 群落中提取的 DNA 通常很复杂，重联率也很低，但是如果在柠檬酸盐溶液和 30%DMSO 中测量时它将会提高。 然而，为了更好的估计 C0t1/2值 需要重复多次以达到 50%的重联率。 大片段的土壤群落 DNA（ 100kb）不用 PCR 扩增就可以直接克隆进 BAC 载体。 从F质粒获得的 BAC 载体可以在大肠杆菌宿主内稳定地保存大的插入序列。 在理论上，BAC 文库可以 容纳全部的微生物群落基因组，并且可以用来绘制基因组图谱、筛选特殊物种、评估系统发育分析和功能多样性。 这可以通过与特殊探针进行杂交、遗传指纹识别和测序来实现。 这种方法的一 个优点是不要通过 PCR 扩增，因而避免了许多其他指纹识别和测序技术中这一步骤的缺陷。 每一个 BAC 克隆代表一个元基因组片段 ，它可能包含具有它们自己启动子的基因和操纵子，从而能够使它们在大肠杆菌宿主中表达。 所以，土壤微生物系统发育和功能之间的关联信息可以通过克隆体的结合研究来隐藏 rRNA，功能性的基因则可以通过克隆和杂交 来获得。 核糖体 RNA 基因（ rDNA） 以及 它们的 转录片段和 rRNA 分子是分类鉴定和衡量微生物遗传多样性最常用的标记物。 基于 rRNA 的方法已经显示了原核微生物中高度发散的系统发生关系， 它代表了地球上 绝大多数的遗传多样性。 这种非培养的 rRNA 方法揭示了新的血统，在系统发生学角度不同于培养方法和特征性的土壤探针。 他们表明来自相似栖息环境不同地理区域的微生物有相关性，但是 具有相同官能团的微生物可能属于不同的系统发生组（亲缘型），这反映了生态位的不同。 Tiedje 等质疑微生物是世界性的这个假说，他们发现每一相同大陆区域每一个 取样点微生物的基因型都是特异性的。 6 土壤微生物群落的遗传指纹图谱和通过比较片段大小或者数据库中的序 12 列来鉴定群落成员 基于 PCR 扩增的遗传指纹图谱方法在分离扩增物方法有很多不同的方法。 像末 端限制性片段长度多态性 ， 这样的新方法使用荧光标记 PCR 扩增物，然后 通过 在自动测序系统中使用 激光检测荧光 DNA 片段来分离 PCR 产物。 基于 PCR 的群落指纹图谱技术有许多的优点， 包括：快速，可以平行分析大量的样品；可靠，高度的可重复性；提供一个群落里的种群的性质和数量上的信息；可以通过比较片段大小或者数据库中的序列来评价群落成员之间的系统发育关系。 但是，基于 PCR 的技术也有很多的缺陷，例如 ：由于优先扩增某些细菌的目标 DNA 序列而导致的 PCR 扩增差异；形成嵌合分子；由于许多的操纵子的存在导致从一株细菌获得许多不同的 PCR 扩增产物；复杂群落的扩增产物数量太多以至于很难分离和分析。 用 DGGE 和 TGGE 的方法 PCR扩增 rDNA 的 DNA指纹图谱可以提供群落组成的信息。 在 DGGE/TGGE 方法中，相同长度但是不同核苷酸序列的 DNA 片段被分离。 这种分离是基于 在一个线性变性梯度聚丙烯酰胺凝胶中 PCR扩增的 DNA分子具有不同的迁移率。 DGGE 依靠变性物质（尿素和甲酰胺）的浓度梯度，而 TGGE 却基于温度梯度。 具有不同序列的 DNA 分子在熔解时将会产生差异。 随着 DNA 分子在变性凝胶中迁移，它们开始在特定的熔解区熔解，因此它们开始变成部 分单链。 部分变性的或者全部变性的分子停止在凝胶中迁移， DNA 片段由于不同的碱基组成和序列而在凝胶上占据不同的位置。 使用可以与可变区附近的保守区退火的引物，对 微生物群落 DNA 中的 rDNA的可变区（ 230500bp）进行 PCR 扩增。 前面的引物与富含 G+C 的序列（ GC夹子，通常达 40bp 长度）相共价连接以阻止双链全部解链。 这种技术的一个不足就是不同生物的 16SrDNA 能够在变性凝胶上形成一条特定的条带。 但是， 当应用于不是很复杂的群落时， 就可以 假设通过 DGGE/TGGE 获得的可辨别的条带代表群落中的大量的优势微生物种群。 群落的分类学组成信息可以通过凝胶印迹和与遗传分子探针杂交、靶标细菌和古生菌中的主要的系统发育亚种。 分离较好的 DGGE 条带可以从凝胶上切下来进行测序。 把 DGGE 条带的序列与数据库中的序列比较，可以获得原来微生物之间的系统发育联系。 DGGE/TGGE 方法分析 从反转录 PCR 的 rRNA 分子获得的 PCR 扩增物或许可以得出代谢活跃的微生物种群的指纹图谱。 DGGE/TGGE 在快速筛选大量样本以区分土壤微生物群落时很有效。 它们在调查微生物群落空间和时间的差异时很方便，可以提供优势菌群的变化信息。 SSCP，像 DGGE/TGGE 一样，可以检测从 rDNA 可变区获得的不同 PCR 扩增物的序列变化。 在 SSCP 中，一个引物是在 5’端磷酸化的，并且扩增物中磷酸化的链被 λ 核酸外切酶选择性的酶切。 完整的链通过在非变性条件下（低温）优化的 SSCP 聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离。 这种优化的凝胶限制双链但是允许 DNA 链的分子内部折叠。 这种 13 方法是基于单链 DNA 的不同分子内折叠，其本身取决于 DNA 序列的变化。 因此， DNA二级结构改变了单链 PCR 扩增产物的电泳迁移速率，从而使其被分辨出来。 这种方法的可重复性和辨别能力取决于片段的大小和片段内序列变化的 位置，通常片段小于400bp 效果最理想。 SSCP 已经被用于区别纯培养的土壤微生物和不同植物不可培养的根围微生物群落的群落指纹图谱。 SSCP 方法原则上比 DGGE/TGGE 方法要容易操作，因为它不需要带 GC 夹子的引物和梯度凝胶所需要的特殊仪器。 除了 PCR 本身存在的误差以外，这种方法的一个不足就是某一单个细菌物种可能 产生许多条带，因为许多操纵子的存在或者单链 PCR 扩增物有很多个构象。 TRFLP方法是基于对末端荧光标记的 PCR扩增物进行限制性核酸内切酶酶切的一种方法。 这些 PCR 扩增物通过使用引物连接到 rRNA 基因可变区附近的一致性序列而从微生物群落 DNA 获得。 两个引物通常都是使用荧光亚磷酰胺染料标记 5’末端。 然后扩增物通过限制性酶切再进行凝胶或者毛细管凝胶电泳分离。 荧光标记的片段可以在自动分析仪里通过荧光检测器进行检测 ，因此，这种技术只检测末端标记的限制性片段。 所以， TRFLP 结合了 PCR、 RFLP 和凝胶电泳三种技术。 通过使用计算机程序在数据库中在 16SrDNA 序列上确定恰当的限制性 酶切位点， 不同的限制性酶切出的 rRNA 的TRF 片段大小差异可以预测出来，实验获得的 PCR 扩增物的 TRF 峰或者从群落 DNA获得的 16SrDNA 克隆文库可以与预测的 TRF 峰或者系统发育分类进行比较。 这些分析方法已经被用来区分群落和研究土壤中的群落结构和动力学。 除了基于 持家基因（例如rDNA）的分析， TRFLP 也被用来分析像汞抗性基因这样的功能基因以及微粒的甲烷单加氧酶基因。 ARDRA 是在细菌鉴定和物种水平分类方面强有力的一个工具，它已经被用来分类大批的分离株 和克隆物。 在 PCR 过程中通过加入荧光标记的 dUTP 获得的荧光 PCR 扩增物可以直接进行自动的 ARDRA。 限制性 酶切得到的片段通过自动 DNA 测序凝胶分离。 然后，酶切样品数据与使用数据库序列获得的已知细菌的 rDNA 限制性分析进行比较。 RISA 是基于 16S 和 23S rRNA 基因之间核糖体基因间隔区的长度多态性，这个间隔区的长度具有菌株或者物种特异性，通常在 50bp 到 1500bp 之间。 PCR 扩增产物经过琼脂糖凝胶电泳分离。 即使很相近的菌株，核糖体的非编码间隔区大小和核苷酸序列都存在变化。 这种方法成功地被用来分类菌株和指纹鉴定简单的群落和混合的种群。 RISA的 自动版本，叫做 ARISA，它使用 荧光标记前端引物来 PCR 扩增内部间隔区。 然后片段进行毛细管电泳，根据大小自动分离，它们的大小可以与 DNA 数据库中的进行比较。 同时使用许多引物靶标相同样品中的不同的系统发生基团可以评估一个群落中的不同微生物种型的种群动力学。 当大量的 PCR 扩增物相似性太高以致于不容易分辨时，遗传指纹图谱方法在区分高度多样性的群落时就有局限。 在复杂的群落中，针对群落的一部分使用引物靶标特殊 14 基因（例如古生菌）或者微生物的功能性基团（产甲烷的），可以利用基于 rRNA 的指纹图谱技术来部分的分析群落。 根 据 Gomes 等报道，区分不同的细菌系统发育群体可以使用以下引物： F984GC,F27,R1378 和 R1494（细菌）和 F243HGC（放线菌）， F203α（ α变形菌） 和 F948β（ β变形菌）。 特殊引物也适用于检测特殊基因，例如类芽孢杆菌，布克氏菌和杆菌。 评估真菌多样性一直是一个问题，因为使用的引物可以同时扩增其他真核生物的 DNA，例如植物、水藻和线虫类的。 由 Vainio 和 Hantula 发现的真菌引物已经被成功的用于研究热带玉米的田间和根围土壤的真菌群落多样性。 另外一个鉴定群落成员的方法就是应用特别的富 集培养基以加快 感兴趣的微生物的生长。 这种方法在研究功能性群体方面特别有效。 杂交技术 该方法是 设计出与 16S rRNA 或者 23S rRNA 序列相应的系统发育寡核苷酸探针 ，然后 用来和 rRNA 数据库中的序列进行比对。 探针的特异性取决于目标序列的变化。 通过选择 rRNA 的保守的、可变的和超变区序列，探针可以标记从域到亚种的不同分类水平的系统发育基团。 土壤微生物群落主要亲缘型的相对丰度可以用群落 DNA 数量点墨杂交或者通过基团特异性系统发育探针进行 FISH（荧光原位杂交）。 在荧光原位杂交方法中，系统发育探针被用荧光染料 标记然后用来做环境样品的单细胞的原位检测 （整个细胞杂交）。 Amann和 Wagner 等提供了关于这方面的步骤和方法学的出色综述。 在probeBase 网 站 可 以 找 到 合 适 的 荧 光 原 位 杂 交 的 探 针（ 杂交方法可以帮助分辨群落中特殊部分（如有机群体）的物种组成。 已经证实，通过使用系统发育探针， 群落指纹图谱的点迹和 Southern印迹杂交 在研究群落变化和鉴定大量 的优势群落成员时很有效。 点墨杂交和荧光原位杂交已经被联合用于区分 不同程度的金属污染的土壤群落结构。 在荧光原位杂交技术中，使用落摄式荧光显微镜即可看到被标记的微生物。 标准的荧光原位杂交方法存在一些缺陷，在敏感度方面它不能检测出低核糖体含量的细胞。 每个细胞的低生理活性往往与低核糖体含量有关，因此，低生长率或者饿死的细胞就有可能检测不出来。 为了克服这个缺陷，人们采用了一种 酪胺信号放大技术 用于 FISH，该技术可以分析缓慢生长的微生物。 FISH 已经被用于鉴定不可培养的 微生物，研究微生物群落的分布和数量。 一系列不同系统发育探针杂交后在显微镜下计数，可以确定体统发育群体的数量和分类学上的个体的相对分布。 克隆 rRNA 基因分析 克隆技术可以替代指纹图谱方法 来分析 PCR 扩增物，并且已经被广泛的用来分析微生物群落。 从环境中获得的 DNA通过克隆载体由 PCR扩增 rRNA基因得到克隆文库。 15 细菌、真菌和古生菌的 rRNA 基因通过使用区域特异性和广泛的引物 已经被独立的 PCR反应扩增出来。 克隆的扩增子可以与指纹图谱方法的进行比较（如 ARDRA）。 然后通过系统发育探针点墨印迹杂交鉴定这些克隆。 对 这些克隆的 rRNA 基因进行测序 ， 然后与数据库中的进行比较可以得出克隆序列之间的联系。 7 使用。