双步激光质谱法对动物组织中药物分子的原位检测毕业论文(编辑修改稿)

双步激光质谱法对动物组织中药物分子的原位检测毕业论文(编辑修改稿)内容摘要：

着 Taylor 锥尖处的溶剂挥发和正电荷的聚集增加，过剩的正电荷克服液体表面张力形成小液滴，最终从 Taylor 锥体的尖端溅射出来。 随着小液滴中溶剂的不断挥发，其体积逐渐减小，电荷密度增加，当液滴中电荷之间的静电斥力大于液滴表面张力的时候，液滴破裂成更小的小液滴，此过程不断重复，样品最终被雾化，形成气相分子离子。 影响初始液滴产生的主要因素有：溶液流速、溶液的电阻系数和溶液的表面张力。 ESI 软电离技术最大的特点是产生多电荷离子，因此可以在不增加对分析器质量检测上限的基础上，提高对大分子检测的能力，适用于极性且包括稳定性差的有机化合物的测定。 电喷雾电离质谱对于高分子化合物的测定由于可以产生多电荷峰，与传统的质谱相比扩大了检测的分子质量范围，同时提高了灵敏度，在 pmol数量级的水平或更少的样品监测中，当分辨率 1000时刻达到 %的精度。 由于其较高的灵敏度且可以分析混合物，目前该方法在生物大分子的检测方面有着广泛的应用[1723]。 同时在生物药学领域也是不可或缺的重要手段，如在糖蛋白、糖肽的糖基化位置以及寡糖组分的测定中都有很好的应用 [2426]。 但对于大分子的蛋白质来说由于要形成非常复杂的多电荷峰，因此分析大分子混合物较为困难，一般只用于分析较纯的大分子化合物，同时溶剂对其分析的影响也非常大。 基质辅助激光解吸电离 (MatrixAssisted Laser Desorption/ Ionization,MALDI） MALDITOFMS（基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱）是近年来发展起来的一种新型的软电离生物质谱，其无论是在理论上还是在设计上都是十分简单和高效的。 19世纪 80年代有几个课题组一直在致力于解决利用激光解吸附离子化样品分子难的问题； 1987年日本 Shimadzu 公司的工程师 Tanaka终于取得重大突破，他在大阪一个研讨会上宣布利用基质辅助激光解吸电离（ MALDI）方法成功的测定了生物大分子，随后于 1987至 1988年间发表了两篇论文对此成果进行了报道，当时 Tanaka是 使用含有细金属粉末的甘油作为基质，虽然这种基质后来并没有得到更好的发展 [27]；紧接着德国的科学家 M. Karas和 利用有机基质（烟碱酸）成功检测了多种蛋白质和寡核苷酸 [28,29]。 从此，不断有新的、更双步激光质谱法对动物组织中药物分子的原位检测 6 高效的基质被报道，例如以多孔硅作为基质，使得 MALDIMS的灵敏度越来越高，应用越来越广泛。 该实验仪器主要由两部分组成：基质辅助激光解吸电离离子源和飞行时间质量分析器。 MALDI的原理如图 12所示：用激光照射样品与基质形成的共结晶薄膜，基质从激光中吸收能量传递给生物分子，而电离 过程中将质子转移到生物分子或从生物分子得到质子，而使生物分子电离的过程，离子在电场作用下加速飞过飞行管道，根据到达检测器的飞行时间不同而被检测即测定离子的质荷比与离子的飞行时间成正比 ，检测离子。 因此它是一种软电离技术，适用于混合物及生物大分子的测定。 MALDITOFMS具有灵敏度高、准确度高及分辨率高等特点，为生命科学等领域提供了一种强有力的分析测试手段，并正扮演着越来越重要的作用。 图 12 基质辅助激光解析电离原理图 Figure 12 The schematic of MALDI MALDI在生物大分子中的应用更多的是测量分子量，如牛碳酸酐酶、牛胰岛素 B链 [30]、胰蛋白酶原 [31]等。 由于 MALDI对于杂质的忍耐性及其高灵敏度，使其也成为低聚核苷酸分析的有效方法 [3233]。 在生物分子的研究中有关的结构信息也是很重要， MALDI亦可以获得部分结构信息 [3435]。 此外， MALDI对于低聚糖[36]、人工合成高分子物 [3738]也可以进行有效的分析。 MALDI方法对于生物大分子的探测很有优势，但对于短肽和氨基酸等小分子效果不好，因为 MALDI需要在待测样品中人为添加基质，并要求其基 质必须与样品形成比较好的共结晶，因此其样品准备的过程较为复杂。 此外，在电离过程中基质产生的碎片离子峰极有可能覆盖需要探测的小分子离子峰。 双步激光质谱法对动物组织中药物分子的原位检测 7 双步激光解析 /激光电离（ L2MS） 双步激光质谱法与 MALDI 质谱方法不同，双步激光质谱法采用两束激光分别完成气化 /解析和电离的任务。 其基本原理如图 13 所示 ： 在双步激光系统中，解析阶段和电离阶段在空间和时间上是相互独立的，这样就可以对每一阶段进行单独优化。 第一束激光为解析激光，其作用是使样品在很短的时间内得以气化，对于热不稳定且难以挥发的物质，此技术极为关 键。 第一束激光一般采用光子能量较小的红外波段的激光 [3940]，但为了特殊需要，也有使用紫外激光 [41]。 当解析激光照射到承载有样品的基体上时，被吸收的光在瞬间大部转换成热能，并传递给待测样品，使其瞬间气化 /解析 [42]。 研究表明，短脉冲激光可以在 10 ns 时间内上升到 108 K 的高温 [43]，如此快的升温速度，可以避免分子因均匀受热而发生裂解。 在解析激光的照射下，在离靶体表面很近 (约 12 mm) 的范围内将会形成一个体积约 1 mm179。 的气团，包含在该气团中的大部分为中性粒子，其中性粒子所占的比例大约是 带电粒子的 1000 倍以上 [5]。 经过一定时间的延迟，第二束激光（电离激光）被聚焦并引入到该气团，优化两者之间的延迟时间 , 这样可以极大地提高电离的效率，有助于质谱信号强度的增强，被电离的离子随后被引入质谱仪中进行检测。 第二束激光可以是紫外光也可以是真空紫外光，真空紫外激光（光子的能量大约为 10 ev）可以通过单光子对绝大多数的分子进行 “软 ”电离 [44]，这样可避免碎片的大量产生。 图 13 双步激光质谱法基本原理示意图 Figure 13 The schematic of L2MS 该技术手段有很 多优点，其一，因解析激光和电离激光在时间和空间上是分双步激光质谱法对动物组织中药物分子的原位检测 8 开的，因此可以根据实际的需要很方便的单独优化两束激光的能量和波长；其次，该实验技术所需要的样品量极少，也不需要在待测样品中人为地添加其它的化学物质作为基质，样品准备简单，避免了样品的二次污染。 同时对于小分子的探测有其独特的优势，可以避免基质背景峰的干扰。 针对该技术， Faccito 提出了一个阶梯－转换（ Ladderswitching）模型 [45]，该模型可以指导我们对所使用两束激光的工作条件进行优化。 该模型主要内容包括：当解析激光能量保持不变时，随 着电离激光（第二束激光）光强的增加，母体离子的信号逐渐增强；当光强继续增加时，母体离子信号便开始减弱，作者的解释是由于过高的能量导致样品发生解离；而当解析激光的能量逐步增加时，出现最佳母体离子信号时所需电离激光的能量呈下降的趋势，作者认为是解析激光能量的增加导致分子更易于被光电离。 作者对多个多环芳烃类分子进行了分析研究，结果表明该类分子均遵守这一规律。 最近， Zare 等详细探讨了该质谱分析方法应用于定性和半定量分析中的各种因素对分析结果的影响 [46]。 作者指出：解析激光的能量和波长，电离激光的能量和光束的准 直，两束激光之间的延迟时间，基底的特性等均会使信号波动进而对定性和半定量的分析产生较大的影响。 其中有些影响很难消除，如解析激光的能量波动和激光束的准直等都会导致结果的不确定性。 双步激光质谱法对动物组织中药物分子的原位检测 9 参考文献 [1] 贾韦韬 , 徐国宾 , 姚均 , 等 . 高效液相色谱检测器 高分辨飞行时间质谱仪的研制 [J]. 质谱学报 , 20xx, 27: 129134. [2] Mumma R O, Vastola F J. Analysis Of Organic Salts By Laser Ionization Mass Spectrometry. Sulfonates, Sulfates And Thiosulfates [J]. Org. Mass Spectrom., 1972, 6: 13731376. [3] Che L, Ren Z F, Wang X G, Dong W R, Dai D X, Wang X Y, Zhang D H, Yang X M, Sheng L S, Li G L, Werner H J, Lique F, Alexander M H. Breakdown of born oppenheimer approximation in the F + oD2 → DF + D reaction [J]. Science, 20xx, 317: 10611064. [4] Qiu M H, Ren Z F, Che L, Dai D X, Harich S A, Wang X Y, Yang X M, Xu C X, Xie D Q, Gustaffson M, Skodje R T, Sun Z G, Zhang D H. Observation of Feshbach Resonances in the F +H2 → HF+H reaction [J]. Science, 20xx, 311: 14401443. [5] Engelke F, Hahn J H, Henke W, Zare R N. Determination of Phenylthiohydantoin Amino Acids by Twostep Laser Desorption Multiphoton Ionization [J]. Anal. Chem., 1987, 59: 909912. [6] 郭长娟 , 黄正旭 , 陈华勇 , 周振 . 飞行时间质谱仪国内研究状况及发展 趋势[J]. 现代仪器 , 20xx, 4: 15. [7] 李燕 , 梁汉东 , 韦妙 , 李良 . 离子阱质谱计的研究现状及其进展 [J]. 质谱学报 , 20xx, 04: 249256. [8] Guilhaus M, Selby D, Mlynski V. Orthogonal Acceleration TimeofFlight Mass Spectrometry [J]. Mass Spectrom Rev., 20xx, 19: 65107. [9] Mirgorodskaya O, Shevchenko A, Chernushevich I, et al. ElectrosprayIonization TimeofFlight Mass Spectrometry in Protein Chemistry [J]. Anal. Chem., 1994, 66: 99107. [10] Smith R, Loo J, Loo R, et al. Principles and Practice of Electrospray Ionization MassSpectrometry for Large Polypeptides and Proteins [J]. Mass Spectrom Rev., 1991, 10: 359451. 双步激光质谱法对动物组织中药物分子的原位检测 10 [11] Dodonov AF． Chernushevich IV． Dodonova TF et al． USSRPatent 1681340A1，1987. [12] Dodonov AF， Kozlovski VI， Soulimenkov IV et a1． High resolution electrospry ionization orthogonalinjection timeofflight mass spectrometer [J]. Eur. Mass Spectrom, 20xx, 6: 481490. [13] Zhen high mass resolving power timeofflight mass spectrometer with orthogonal extraction and a gasfilled radio frequency quadrupole interface [M]. Germany: Giessen University Thesis, 20xx. [14] 王华斌，刘钟栋，等 .浅析电喷雾质谱仪中的电喷雾系统 [J]. 中国食品添加剂 , 20xx, 5: 9599. [15] Whitehouse C M, Dreye R N, Yamashita M, et al. Electrospray interface for liquid chromatographs and mass spectrometers [J]. Anal. Chem., 1985, 57: 675679. [16] Yamashita M, Feen J B. Electrospray ion sourse. Another variation on the free jet theme [J]. J. Phys. Chem., 1984, 88: 4450. [17] Hofastadle S A, Wahl J H, Bruce J E, et al. Online capillary eletro。