几丁质对海洋生防酵母抑菌活性的影响及相关机理的研究毕业论文(编辑修改稿)

几丁质对海洋生防酵母抑菌活性的影响及相关机理的研究毕业论文(编辑修改稿)内容摘要：

和苯菌灵（ Benomyl）等被美国环保机构所禁用，并部分或全部的自动退出采后应用市场。 此外由于长期使用杀菌剂，病原菌进化 并 产生了大量抗药性菌种。 因此，找到一种新的安全的可以替代化学杀菌剂，控制果蔬采后病害的新方法具有非常重要的意义。 果实采后病害 物理 防治 果蔬采后病害防治物理方法主要有：热处理；低温冷藏 ； 微波处理；气调；辐射处理；低压处理。 低温冷藏技术已经在部分地区得到实际运用，热杀菌和辐照杀菌也是目前报道比较多的方法。 低温冷藏是一种常用的 保鲜技术。 近几年来，低温冷藏技术又有新的发展，采用临界点低温高湿存储，即控制在物料冷害点温度以上 ℃ ～ 1℃ 和相对湿度为 90％～ 98％的环境中存储保鲜果蔬。 果蔬果实在不发生冷害的前提下，采用尽可能低的温度可以有效地控制果蔬果实在货架期内的呼吸强度，使某些容易腐烂的果实处于休眠状态；其次采取相对高湿的环境可有效降低果蔬水分蒸发而减少失重（刘忆冬等， 20xx）。 冷 藏 技术最大的局限性在于低温只能抑制病原菌，不能根除，而且一些热带、亚热带果蔬果实在低温下冷害情况严重（任红等， 20xx）。 由于低温贮藏、辐照处理和 热处理等物理方法都需要特定的设备，这些方法在执行起来受到成本、产地、运输条件等限制。 目前，在经济发达地区，低温贮藏链结合化学杀菌剂是比较成熟的商业采后处理技术。 哈尔滨工业大学学士学位论文 第一章 文献综述 4 果实采后 病害 生物防治 从可持续发展的角度出发，开发新型、高效且安全的有机、绿色的保鲜剂具有重大的社会意义和广阔的应用前景。 例如在美国，有机产品的产值已从 1997 年的 亿美元增长到了 20xx 年 145 亿美元（ Prange et al., 20xx）。 利用安全且有拮抗病原菌活性的微生物进行生物防治的方法近 10 年来已经取得了突破性的进展， 被认为是最有希望替代化学杀菌剂的方法之一（ Janisiewicz 和 Korsten,20xx）。 目前已经有 4 个基于拮抗微生物的生物防腐剂产品： Aspire（基于拮抗酵母 Candida oleophila，美国）， Yield Plus（基于拮抗酵母 Cryptococcus albidus， 南非）， BioSave 10LP（基于拮抗细菌 Pseudomonas syringae strain，美国）和 Avogreen（基于拮抗细菌 Bacillus subtilis，南非）（ Janisiewicz 和Korsten， 20xx； Fravel， 20xx）。 利用拮抗酵母进行水果采后病害的生物防治具有许多其他方法无法比拟的优点：如遗传稳定，抑菌谱广，效价高；一般不产生对人和寄主有害的代谢产物，安全性高；对营养要求低，生长快；对多种胁迫、逆境具有较强的耐受力，对大多数杀菌剂不敏感，能与多种化学和物理方法相容等（ Janisiewicz 和 Korsten, 20xx； Spadaro 和 Gullino, 20xx）。 它 对于保护生态环境、减少食品农药残留、保障公众健康具有重要意义， 因此 成为当前国内外的研究热点。 采后拮抗酵母作用机 制 根据已有的研究结果显示，微生物对病原菌有直接作用和间接作用两种方式，直接作用包括抗生作用和重寄生作用，间接作用包括营养和空间的竞争，胞外活性物质的产生和诱导抗性等。 生防通常是一个以上的机制共同作用的结果。 营养和空间的竞争 为了抑制病原菌的侵染 , 拮抗菌必须在病原菌到达以前或到达以后的很短时间内在果实表面侵染部位占据优势。 拮抗菌与病原菌争夺的营养物质主要是碳水化合物、氮源等。 Filonow（ 1998） 用 14C 标记的果糖、葡萄糖、蔗糖检验在苹果伤口处的拮抗菌罗伦隐球酵母（ C. laurentii）、掷抱酵母（ S. roseus）与病原菌灰葡萄孢孢子在营养利用上的差别，发现拮抗菌摄取和利用 14C 果糖的量越大，对分生孢子萌发的抑制作用越强，说明营养竞争是重要的生防机制。 在对 E. herbicola B66和 B90 抑制苹果青霉病和灰霉病 的研究中发现 ，在稀释的苹果汁中， B66 和B90 能抑制灰葡萄孢和扩展青霉分生孢子的萌发并溶解其萌发管（ Sobiczewski et al, 1996） ，但 在未稀释的苹果汁里这些反应并不明显，说明营养竞争在这里起到了非常重要的作用。 在国内，范青等的研究也发现将季哈尔滨工业大学学士学位论文 第一章 文献综述 5 也蒙 毕赤 酵母 （ P. guilliermondii） 接种到桃果实的伤口上，在有病菌存在时该拮抗酵母菌的数量一天内可以猛增 200 多倍，这种高速的繁殖活动反映出拮抗菌与病原 菌 之间的营养竞争。 Janisiewicz 等（ 1992）报道在苹果等果实伤口处，糖类营养物质非常丰富，而作为氮源的氨基酸等则相对贫乏，成为竞争的焦点，通过向苹果伤口加入拮抗菌容易利用而病原菌难以利用的 L天冬氨酸和 L脯氨酸能显著提高拮抗效果。 此外，酵母分泌的胞外多糖也能促进果实表面的粘结作用从而在空间竞争上占据优势 (Andrews et al., 1994)。 已有的研究结果显示，生防菌在果实伤口处接种越早，其对果蔬采后病原菌的抑制效果越好（ ChandGoyal and Spotts, 1997。 Fan and Tian, 20xx）。 这也反映了营养与空间的竞争可能是海洋酵母抑制致病原菌的重要机理之一。 营养和空间的竞争还被认为对病原真菌的次级代谢有作用（ Bjornberg and Schnurer, 1993。 ChandGoyal and Spotts, 1996）。 环境营养对病原菌的次级代谢，包括真菌毒素的产生具有重要影响（ Luchese and Harrigan, 1996）。 这可能是一些酵母拮抗菌能在体外试验中抑制霉菌菌丝生长的原因之一。 比如Petersson和 Schnurer（ 1995） 发现 P. anomala能在体外试验中减少 P. roquefortii和 亮白曲霉 (Aspergillums candidus)的数量。 重寄生作用 许多酵母拮抗菌可以分泌胞外水解酶（几丁酶， β1,3葡聚糖酶等），从而分解病原菌的细胞壁或菌丝体。 Gravese 等（ 1998）报道 P. anomala K 对抑制苹果灰霉病非常有效，因为灰葡萄孢细胞壁能诱 导 其在 苹果伤口上 分泌的胞外 β1,3葡聚糖酶的量增加 3 倍。 出芽短梗霉 （ A. pullulans） 能显著抑制苹果等水果采后多种病原菌， Castoria R 和 Ippolito A 等 （ 20xx） 在出芽短梗霉 （ A. pullulans） 处理过的苹果伤口上检测到了浓度更高的 β1,3葡聚糖酶和几丁酶活性。 拮抗菌的快速定植和水果本身酶的诱导作用可能导致了胞外溶解酶的 数量增加。 但需要进一步研究这些酶的来源及其在生物防治中的作用。 某些酵母菌还可以附着在病原菌上，形成对病原菌的直接寄生作用。 Arras（ 1996） 用电镜 观察到拮抗菌无名假丝酵母 (C. famata)可以在病菌菌丝上定植，并促使菌丝裂解。 EIGhaouth（ 20xx） 发现拮抗菌 C. saitoana 在苹果伤口处可以紧紧吸附在灰葡萄孢的菌丝上。 这些吸附现象不能完全说明在拮抗菌与病原菌之间有重寄生作用，但可以肯定这种现象与拮抗菌的生理活动紧密联系，因为经过热杀死的拮抗菌不再有吸附现象发生。 胞外活性物质的产生 一些研究结果显示，拮抗菌与病原菌互作时 , 在果实伤口部位生长的酵母细胞外围有大量的新生物质。 这些胞外活性物质可能参与了拮抗菌与病原哈尔滨工业大学学士学位论文 第一章 文献综述 6 菌之间的相互 作用（表 ）。 表 主要产胞外物质菌株 诱导抗性 近 5 年来，拮抗 菌 诱导采后果实抗性 成为了生物防治的研 究热点。 已有的大量 研究表明 ， 多种 生防 菌，包括出芽短梗霉 （ A. pullulans） 、 C. saitoana、C. oleophila、膜醭毕赤酵母 （ P. membranefaciens） 和罗伦隐球酵母 （ C. laurentii）等均 能诱导多种果实的抗性及抗性相关反应 ，提高果实自身抗性，减少采后腐烂 （表 ） （ Filonow, 1999, 20xx。 Ippolito et al., 20xx）。 生防菌作为 激发子 ， 具有生物可降解和性价比高等优良特点，因此具有良好的应用前景。 抗生作用 通过拮抗菌产 生抗生素抑制病原菌作用是人们最早发现的一种拮抗机理，也是大多数拮抗细菌最主要的机制之一（表 ）（ Janisiewicz and Roitman, 1988。 Janisiewicz et al., 1991）。 但是，在体外试验中能产生抗生素的菌株中很大一部分不能在体内试验中产生抑菌效果，这是由两方面的原因造成的：有些细菌只能在“ in vitro”环境中产生抗生素，而在“ in vivo”则不产生抗菌素；一些细菌不适应寄主伤口的环境，不能存活或生命力下降，因此不能产生很好的拮抗效果。 而且能在寄主上保持拮抗能 力的细菌仍具有两个弊病：首先，抗生素有可能诱导病原菌产生抗性，从而逐步降低拮抗菌对病害的控制效果；其次，拮抗菌产生的抗生素对食用者也可能产生不利影响。 因此进入 20 世纪 90 年代以后，拮抗菌的研究重点逐步从拮抗细菌转向了拮抗酵母。 抗生素名称 产生菌株 针对 病原菌 蒿属香豆素、东莨菪亭 无名假丝酵母 (C. famata) 指状青霉 毒性蛋白 (killer protein) 毕赤酵母属 (Pichia sp.) 抗细菌物质 罗伦隐球酵母 （ C. laurentii） 荧光假单胞菌、 Staphylococcus aureus 挥发性物质 乳酸克鲁维酵母 (Kluyveromyces lactis) 扩展青霉 哈尔滨工业大学学士学位论文 第一章 文献综述 7 表 采后拮抗 菌 对果实抗性的诱导及对抗性相关反应的刺激 果实 拮抗菌 备注 苹果 出芽短梗霉 C. saitoana 刺激果实几丁质酶、葡聚糖酶和 POD 诱导抗性，并刺激果实几丁质酶、 1,3葡聚糖酶 分泌 1,3葡聚糖酶 柚子 柑橘 C. oleophila 诱导抗性，并刺激果实乙烯、 PAL, 几丁质酶、 1,3葡聚糖酶、积累植保素等 刺激果实硫还原蛋白基因表达 刺激几丁质酶 cDNA 的表达 刺激 1,3内葡聚糖酶基因表达 草莓 出芽短梗霉 诱导抗性 樱桃 番茄 膜 醭毕赤酵母 刺激果实 POD，降低 CAT 和 SOD，提高总蛋白，增强 33和 47kDa 蛋白 刺激果实几丁质酶、 1,3葡聚糖酶 桃 、梨、枣、苹果 罗伦隐球酵母 诱导果实抗性；刺激果实几丁质酶、 1,3葡聚糖酶、 POD和 PAL 活性 刺激果实 1， 3葡聚糖酶基 因表达 表 主要产抗生素菌株 抗生素名称 产生菌株 作用对象 病原菌 伊枯草菌素 枯草芽孢杆菌 B3 核果类水果 M. fructicola 吡咯菌素 洋葱假单胞菌 (P. cepacia) LT412W 梨果 、柑橘 核果类水果 扩展青霉、灰葡萄 孢 丁香霉素 E 丁香假单胞杆菌 ESC10 和 ESC11（ BioSave） 柠檬 吡喃酮 木霉 草莓、苹果 灰葡萄孢 拮抗菌生理调控及机理的研究 近年来，随着拮抗菌和病原菌之间 的 细胞学、生物化学和分子生物学研究的不断深入发展，研究者发现 通过调节采后拮抗酵母的生理代谢机制可能是增强其拮抗能力的有效途径之一（ Janisiewicz 和 Korsten, 20xx）。 根据有限的已发表资料，关于采后拮抗菌生理调控及机理的研究可概括为以下三个方面： 逆境培养 Teixid243。 等（ 1998）研究表明通过低水分活度培养 Candida sake 后其在采前使用时生长数量明显增加并增强了酵母的拮抗效力，其机理与积累糖醇和海藻糖有关； Bonaterra 等 （ 20xx） 报道在培养基中添加 NaCl 后能提高 P. agglomerans EPS125 在不同湿度贮藏 条件下的生防效力，作用 机 制 也 与拮抗哈尔滨工业大学学士学位论文 第一章 文献综述 8 菌体内海藻糖等物质的积累有关。 西班牙 XaRTApostharvest 实验室 的 研究者发现 经 盐胁迫诱导培养的 P. agglomerans CPA2 在 冷冻干燥或喷雾干燥后，细胞的存活率比未经诱导培养的菌株有显著的提高， 且 冻干粉单独使用或结合佐剂 Fungicover 使用，对果实病害的抑制效果均显著高于未经胁迫的新鲜酵母。 拮抗 物质的。