农杆菌介导的水稻转化体系的优化毕业论文(编辑修改稿)

农杆菌介导的水稻转化体系的优化毕业论文(编辑修改稿)内容摘要：

........................................................................21 水稻叶片 DNA提取 .........................................................................................21 水稻转基因再生植株潮霉素抗性检测 ................................................................22 转基因植株的 PCR 检测 ...................................................................................22 .............................................................................................................. 23 新型 Bt 基因含选择标记农杆菌转化载体的构建与鉴定 ...............................................23 含新型 Bt 基因中间载体 pUPROKCry30Fa1与 pUPROKCry54Aa1的构建与鉴定 ................................................................................................................................23 含新型 Bt 基因双元载体 pCDMARCry30Fa1Hyg与 pCDMARCry54Aa1Hyg的构建与鉴定 ..................................................................................................................25 籼性水稻成熟胚 愈伤组织的获得 ................................................................................28 抗坏血酸对籼性水稻成熟胚愈伤组织获得的影响研究 .......................................28 继代次数对籼性水稻成熟胚愈 伤组织获得的影响 ..............................................29 农杆菌介导的转新型 Bt 基因籼性水稻的获得 .............................................................29 筛选压对愈伤组织转化率的影响 .......................................................................30 干燥处理对愈伤组织分化的影响 .......................................................................31 转基因抗性植株 T0 代的检测 ......................................................................................33 转基因抗性植株 T0代离体叶片的潮霉素检测 ....................................................33 转基因再生植株 T0代的 PCR 检测 ....................................................................34 ..................................................................................................................... 35 新型杀虫基因 Cry30Fa1 与 Cry54Aa1 的实际应用性 ...................................................35 籼稻愈伤组织的培养与转化体系的优化 ......................................................................36 组织培养过程中的褐化问题 ..............................................................................36 愈伤组织继代次数对转化率的影响 ...................................................................37 干燥处理对抗性愈伤组织分化的影响 ................................................................37 筛选压对抗性愈伤组织获得的影响 ...................................................................38 双 TDNA 共转化获得去除标记基因的转基因植株 ......................................................38 用离体叶片检测转基因水稻对潮霉素抗性的可行性 ....................................................39 ................................................................................................................. 40 参考文献 ........................................................................................................................... 41 致谢 .................................................................................................................................. 48 附录 .................................................................................................................................. 49 1 水稻是世界上最重要的粮食作物之一， 为 世界上近 30 亿 的 人口 提供了 主要 的食物，并且 是 我 们 饮食 中 35%60%的能 量 来源 [1]。 据统计，到 2025 年水稻产量需增加60%才能满足日益增长的人口需求 [2]。 因此， 在世界人口 快 速增加 和土地资源锐减 的今天，提高单位面积土地的水稻产量具有 非常 重要意义。 同时， 水稻也是虫害最多的粮食作物之一，田间害虫种类达 624 种以上，每年 仅由于螟虫危害所造成的直接经济损失就达 亿元，使用化学杀虫剂防治螟虫的费用每年达 亿元，所以每年由稻螟 虫 危害引起的总经济损失就能达到 亿元 [3]。 我国 每年因虫害造成的产量损失占水稻总产 量 的 5% 以上，给水稻的 生产带来了极大危害。 因此，减少病虫危害是 降低生产成本、 提高水稻产量的一个重要途径。 长期以来，害虫防治过多的依赖于化 学农药。 化学农药的施用在减少虫害的同时还伴随着一些副作用，如提高 生产 成本、污染 生态 环境、危害人体健康、 破坏生态系统、诱 导害虫产生抗药性、 杀死害虫的天敌、 引起次要害虫的大发生等，从而使 化学农药控制虫害的方法在生产应用受到了一定的限制。 随着现代生物技术的迅猛发展，植物抗虫基因工程 研究不断深入，人们对农作 物 虫害的防治逐渐形成了新的思路与途径。 通过基因工程手段 转入外源抗虫基因， 培育抗虫新品种可从根本上解决问题， 而且对哺乳动物和一些有益昆虫不产生毒害作用，也 不 会 造成环境污染， 在 生产上 具有广阔的应用前景。 目前，人们已从植物本身 、细菌中 以及 一些动物 体内发现并分离 克隆 到许多抗虫基因， 其中某些 抗虫 基因已 转 入 农作物并进行田间试验，并有一些品种已商品化， 其中 以 转苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白基因进入 植物 的 研究最为广泛和深入。 抗虫基因的种类及特点 目前 我们 已经发现并获得了很多种抗虫基因， 这些抗虫基因 根据 来源进行分类， 大体可以分为 以下 三类 ：第一类是从细菌如苏云金芽孢杆菌中 分离得到的抗虫基因，主要是 Bt 毒蛋白基因；第二类是从植物中分离出来的基因，包括 2 蛋白酶抑制剂基因，外源凝集素基因，淀粉酶抑制剂基因等；第三类是从动物体内分离出来 的 毒素基因，如 蜘蛛毒素基因和蝎毒素基因 等 [4]。 Bt毒蛋白基因 （ 1） Bt 毒蛋白的作用机理 Bt 毒蛋白基因是水稻抗虫基因工程中运用最为广泛的基因之一，它来源于一种革兰氏阳性菌苏云金芽孢杆菌 (Bacillus thuringensis， Bt)。 苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白（ Insecticide crystal proteins， ICPs）又称 δ内毒素 ， 是一类在苏云金芽孢杆菌芽孢形成期产生的具有特异杀虫活性的晶体蛋白，其在伴孢晶体内以原毒素的形式存在。 当被昆虫摄食之后在昆虫 的肠道内经蛋白酶水解转变为带有末端且 具 有杀虫活性的毒性多肽分子，它可与敏感昆虫中肠上皮细胞表面的特异受体相互作用诱导细胞膜产生一些特异性小 孔扰乱细胞内外的 渗透 压，引起细胞膨胀甚至裂解 ， 从而导致昆虫停止进食， 最终死亡 [5]。 （ 2） Bt 毒蛋白基因分类 由于苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白基因具有多样性， Bt 毒蛋白的基因分类一直是细菌学家 们 争论不休的问题，直到 1975 年才正式列为一个独立的种，种以下又根据鞭毛抗原的血清型和生理生化特征的不同分为不同的亚种，后来由于无鞭毛亚种的出现，又把营养细胞的酯酶型作为辅助分类依据 [6]。 据粗略统计，已经有60 余种 Bt 基因被报道。 ICPs 与昆虫肠道细胞表面受体相互作用的特异性决定了 Bt 毒蛋白的抗虫谱。 不同基因型杀虫谱不同，毒蛋白的大小及形状也不一样。 根据它们杀虫谱的范围，可将 Bt 杀虫基因分成六大类，即 CryⅠ 、 CryⅡ 、 CryⅢ 、CryⅣ 、 CryⅤ 和 Cyt。 在每一类型下根据氨基酸序列的同源性，又分为 A， B，C 等不同的基因型。 在同一基因型下根据限制性内切酶的酶谱和分子量的大小，又分为 a， b， c 等不同的基因亚型 [7]。 其分类如表 [8]。 3 表 目前发现的一些 Bt 毒蛋白大体分类及杀虫谱 The general classification of Bt δendotoxin found currently and insecticidal spectrum 种类 毒蛋白名称 杀虫范围 CryⅠ CryIA(a) CryIA(b) CryIA(c) CryIB CryIB(b) CryIC CryID CryIE CryIF CryIG CryIX 鳞翅目 CryⅡ CryIIA CryIIB CryIIC 鳞翅目、双翅目 CryⅢ CryⅢ A CryⅢ B CryⅢ B2 CryⅢ C CryⅢ D 鞘翅目 CryIV CryIVA CryIVB CryIVC CryIVD 双翅目 CryV CryVA(a) CryVA(b) CryVB CryVC 鞘翅目、鳞翅目 Cyt CytA 双翅目 蛋白酶抑制剂基因 蛋白酶抑制剂 (Proteinase Inhibitor， PI)是 植物本身起防御作用的 并且是自然界 含量最丰富的 蛋白质种类之一，而且某些纯化的蛋白酶抑制剂对昆虫的生长和发育具有明显地抑制作用 [9]。 其抗虫机理 是 在昆虫的消化道内 PI 能与蛋白消化酶作 用，形成酶抑制剂复合物 (EI)，消化酶的蛋白水解作用 被阻断或减弱 ；同时， 消化酶在 EI 的刺激下会 过量分泌，通过神经系统 的反馈作用 ，使昆虫 产生厌 食 反应 或消化不良，从而 杀死昆虫 达到抗虫目的 [10]。 在植物中 ，目前 发现的蛋白酶抑制剂主要有三类 :丝氨酸蛋白酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂 、巯基蛋白酶抑制剂 [11]。 其中 用来抗虫且 研究最多是丝氨酸蛋白酶抑制剂，这是因为 膜翅目、直翅目、双翅目 以及 大部分鳞翅目和某些鞘翅目昆虫消化道内的消化酶 是丝氨酸蛋白酶 [12]。 目前已经有 多种植物导入 了 丝氨酸 蛋白酶抑制剂基因 ， 其中豇豆胰蛋白酶抑 制剂（ CpTI）是 抗虫效果 最为有效的 丝氨酸 蛋白酶抑制剂，现已 有多种植物如 棉花 [13]、烟草 [14]、水稻 [15]等 导入了 CpTI 基因 ，。